大肠杆菌中苹果酸脱氢酶和丝氨酸乙酰转移酶消去化修饰的鉴定

摘要

消去化修饰是近年来发现的一种新的罕见的蛋白质翻译后修饰，是指通过巯基进攻不饱和氨基酸从而发生米歇尔共价加成反应。目前发现的消去化修饰蛋白只有三种，晶状体蛋白、MAPKs和Glutathione peroxidase,而多肽有200多种。对于消去化修饰的鉴定，目前科学界并没有较好的研究方法，为填补这一空白，发现更多的具有消去化修饰的蛋白质及多肽，我们在本实验室已经成熟的标记探针基础上对大肠杆菌 BL21(DE3)裂解液进行标记，并鉴定到了221个可能具有消去化修饰的蛋白。选取其中两个大肠杆菌中鉴定到的可能具有消去化修饰的蛋白，苹果酸脱氢酶和丝氨酸乙酰转移酶，进行后期条件更加严格的鉴定。
　　首先通过构建重组菌在大肠杆菌 BL21(DE3)中进行诱导表达,选用 Ni-TED进行亲和层析纯化得到纯度较高的苹果酸脱氢酶以及丝氨酸乙酰转移酶，利用成熟探针bio-SH试剂对目的蛋白进行初步标记，发现二者具有较好的Michael加成效果。同时为验证所使用的化学探针bio-SH试剂的特异性，排除反应中可能存在非特异性，选择在加成反应过程中加入已验证的具有加成效果的DTT试剂进行竞争，发现苹果酸脱氢酶和丝氨酸乙酰转移酶Michael加成反应有一定程度的减弱，近而说明了化学探针bio-SH试剂具有特异性。
　　其次，将bio-SH试剂进行过化学标记的蛋白与Streptavidin-NHS beads进行室温孵育，对两个目的蛋白进行特异性富集纯化，为后边进行质谱检测奠定了基础。
　　最后，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对大肠杆菌中苹果酸脱氢酶进行敲除，随后通过对其基因缺陷株进行回补以及表达纯化。对目的蛋白进行特异性化学标记后，比较过表达蛋白与正常表达蛋白之间加成效率的差异。其中在缺陷株中蛋白过表达后其加成效率要高于大肠杆菌BL21(DE3)中正常表达的蛋白。
　　本课题建立在本实验室成熟的探针标记基础上，对大肠杆菌中苹果酸脱氢酶和丝氨酸乙酰转移酶进行化学标记，在排除非特异性反应的条件下对二者进行挂柱效率的检测，并通过MDH基因敲除系统的建立，比较蛋白过表达后的加成效率为后边质谱检测以及研究蛋白之间相互作用奠定了基础。同时，该鉴定方法也为后边近一步研究消去化修饰蛋白与多肽的鉴定提供了理论基础。

目录

声明

第1章 文献综述

1.1蛋白质翻译后修饰

1.2消去化修饰

1.3大肠杆菌中苹果酸脱氢酶

1.4大肠杆菌中的丝氨酸乙酰转移酶

第2章 引言

2.1 研究背景

2.2 研究目的与意义

第3章 材料与方法

3.1实验材料

3.2实验试剂

3.3实验仪器

3.4实验方法

第4章 结果与分析

4.1 重组质粒Pet28a-MDH, Pet28a-CysE的构建及结果

4.2 大肠杆菌中苹果酸脱氢酶（MDH）与丝氨酸乙酰转移酶（CysE）的诱导表达及纯化结果

4.3 MDH与CysE的化学标记效率检测

4.4利用DTT与bio-SH试剂竞争来检测反应的特异性

4.5 bio-SH试剂标记的目的蛋白富集效果

4.6柱上酶解后肽段标记效率检测

4.7大肠杆菌中MDH 缺失菌株的建立

第5章 讨论与总结

参考文献

附录

致谢

在读期间所发表的论文与科研情况