桑树茉莉酸生物合成与信号转导途径基因的鉴定和功能研究

摘要

植物激素是由植物体产生的一类代谢产物，具有低浓度高效应的特点。植物激素具有广谱的生理作用，在植物生长发育的各个过程（细胞分裂、向性生长、器官形成、开花、种子发育、衰老）和环境应答（如高温、盐碱、病虫害）中都发挥重要功能。
　　茉莉酸是一种环戊酮类植物激素，最早从真菌的滤液中分离出来。茉莉酸广泛分布于植物的各个组织。已有大量研究表明茉莉酸在植物防御植食性昆虫方面作用突出。目前，茉莉酸的生物合成与信号转导机制已在模式植物中被阐明。
　　桑树是一种多年生木本植物，除传统的栽桑养蚕外，桑树在生态、保健、医药方面的作用也十分突出。但在自然条件下，桑树的虫害非常严重，传统的喷洒农药不仅容易使害虫产生耐药性，还会对人类健康造成影响。因此，提高桑树抗虫害能力对桑树产业的发展具有重要意义。
　　本研究利用生物信息学的方法从川桑（Morus notabilis）全基因组数据库中鉴定了参与桑树茉莉酸生物合成与信号转导通路的基因，并对其进行生物信息学分析。随后，采用家蚕咬食和机械损伤处理的川桑组培苗作为材料进行转录组测序，分析两种处理方式下川桑体内基因的表达情况以及激素相关基因的动态变化，继而通过酵母双杂交筛选茉莉酸信号转导通路关键蛋白MnNINJAl和MnNINJAs的互作蛋白，最后通过转基因拟南芥对MnNINJAl和MnNINJAs进行功能研究。本研究所获研究结果如下：
　　1、川桑茉莉酸生物合成与信号转导通路基因的鉴定和信息学分析
　　利用生物信息学的方法，我们在川桑基因组中共鉴定到74个参与茉莉酸生物合成与信号转导通路的基因，其中39个基因参与茉莉酸的生物合成，另外35个基因参与其信号转导。结构域分析显示这些基因在川桑中非常保守，聚类分析结果表明这些基因在川桑中的表达具有组织偏好性。
　　OPR是茉莉酸生物合成途径的关键酶。川桑中有7个OPR基因，它们串联排布在3个scaffold上。系统发生分析表明在川桑中可能有两个OPR基因催化茉莉酸的生物合成，同时，还鉴定到一类之前未鉴定到的Group III分支的OPR蛋白，它们全部来自单子叶植物。顺式作用元件分析表明MnOPR基因可以响应多种激素处理和环境胁迫。
　　JAZ是茉莉酸信号转导通路的抑制因子。在川桑中鉴定到6个MnJAZ基因。同其它已报道植物物种相比，川桑JAZ基因数目最少，冗余度较低。对这6个MnJAZ基因进行克隆，发现同拟南芥相比，川桑MnJAZ基因结构非常保守。序列比对发现川桑中同样存在截短形式的 MnJAZ5。多序列比对和系统进化分析显示除MnJAZ4以外，其它JAZ蛋白都含有保守的TIFY和Jas结构域，这两个结构域分别被一个保守的内含子隔开。定量PCR分析显示在川桑中6个MnJAZ基因具有不同的组织表达模式。
　　在川桑基因组中，我们鉴定到拟南芥 AtNINJA的同源基因，但是该基因长度明显变短，其编码的蛋白质缺失了N端保守的EAR基序。基于此，我们通过设计简并引物的方法对川桑NINJA基因进行克隆，最终克隆到全长MnNINJA，多序列比对表明该基因在植物中非常保守。同时，我们在川桑cDNA上也克隆到预测的MnNINJA基因，序列比对发现川桑中MnNINJA存在选择性剪切，我们将其产生的两种转录本形式分别命名为MnNINJAl和MnNINJAs。
　　2、咬食和机械损伤处理下川桑的转录组分析
　　我们采用家蚕咬食和机械损伤这两种处理方式，收集处理后1h、8h、16h这三个时间点（分别代表早期、中期、晚期）的川桑组培苗叶片进行转录组测序。以处理前后表达量变化大于1.5倍作为差异基因的筛选标准对转录组数据中的差异基因进行分析，在8h时间点，川桑体内差异基因的数目最多。热度图分析表明在处理后1h和8h时间点，咬食和机械损伤处理下川桑体内差异基因的表达模式相近，而在16h时间点，表达模式差异较大。KEGG富集分析显示在1h时间点，α-亚麻酸途径显著富集，而在8h和16h时间点，光合作用相关通路显著富集。
　　对转录组数据中参与茉莉酸生物合成途径的基因进行分析，发现MnAOS1、MnAOC1、MnOPR6、MnLOX2C、MnOPCL1被强烈诱导，说明在处理的早期阶段川桑体内大量合成茉莉酸。茉莉酸信号转导通路中，MnMYC2仅在1 h时间点显著上调，MnJAZ1、MnJAZ3、MnJAZ4在各个时间点均强烈表达。咬食处理下MnJAZs的表达水平检测表明转录组测序的结果可靠。我们对咬食和损伤处理下参与其它激素途径的差异基因进行聚类分析，大量参与赤霉素、乙烯、水杨酸、脱落酸等激素生物合成与信号转导途径的基因被强烈诱导，其中，大部分参与赤霉素、生长素信号转导途径的基因在处理后表达量出现下调。
　　在转录组数据中我们没有鉴定到MnNINJAl。通过家蚕咬食川桑幼苗叶片，选取0h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h这7个时间点对MnNINJAl的表达情况进行检测。定量PCR结果显示MnNINJAl的转录本呈现出先降低后升高的趋势，并且在损伤部位与未损伤部位的表达模式相似。激素处理实验表明MnNINJAl除响应茉莉酸甲酯以外，还可以响应水杨酸、赤霉素和乙烯的诱导。Western Blot分析表明MnNINJAl在川桑的八个组织中均有表达，在幼叶中表达量最高，并且转录本水平与蛋白水平趋势不一致，而MnNINJAs在川桑各个组织中均未检测到表达。
　　3、MnNINJAl和MnNINJAs的功能研究
　　通过酵母双杂交的方法，我们筛选了MnNINJAl和MnNINJAs的互作蛋白。采用酵母细胞融合进行筛选，我们最终筛选到与MnNINJAl和MnNINJAs互作的阳性克隆分别为6个（含8个基因）和3个（2个基因）。回复验证后，与MnNINJAl互作的克隆中只有编号为14、52、99和100为阳性，其它均为自激活或假阳性，与MnNINJAs互作的2个基因全部为阳性。由于在筛选过程中MnJAZ4、MnJAZ5与MnNINJAl互作，MnJAZ1、MnJAZ3与MnNINJAs互作，因此我们对6个MnJAZ全部构建猎物载体，酵母双杂交结果显示6个MnJAZ蛋白都能和MnNINJAl发生互作，而MnNINJAs与MnJAZ4相互作用较弱，与剩余5个MnJAZ蛋白均能互作。我们对编号为99和100的两个基因进行分析，他们分别编码类泛素结合酶（SUMO-conjugating enzyme，SCE1）SCE和4-香豆酸-辅酶 A连接酶（4-coumarate-CoA ligase-like5，OPCL1），我们将其命名为MnSCE1和MnOPCL1。OPCL参与茉莉酸的生物合成，在咬食和机械损伤处理下被强烈诱导。SCE1参与蛋白的类泛素化过程，在脱落酸响应、拟南芥幼苗发育、温度响应以及病毒侵染植物的过程中都发挥重要作用。
　　我们利用植物转基因技术在模式植物拟南芥中异源表达川桑MnNINJAl和MnNINJAs。定量PCR和Western Blot实验表明MnNINJAl和MnNINJAs在拟南芥中过量表达。同野生型拟南芥相比，转基因拟南芥在表型上没有表现出明显的差异。我们随后选取茉莉酸响应基因AtPDF1.2、AtVSP2进行定量PCR检测。AtVSP2在过表达MnNINJAs的拟南芥株系中表达量显著下调，而AtPDF1.2的表达不受影响。MnNINJAl可以上调AtPDF1.2的表达。对于AtVSP2，MnNINJAl在一定浓度范围内可以上调其表达，超过阈值后则会抑制其表达。同时，MnNINJAl和MnNINJAs在拟南芥中过量表达也会影响其它激素响应基因的表达水平。水杨酸响应基因AtPR-1和和脱落酸响应基因AtERD10的表达均出现上调，生长素响应基因AtIAA11和AtARF8的表达全部出现下调的趋势。拟南芥中过量表达MnNINJAl和MnNINJAs也显著影响了赤霉素响应基因AtGASA1和AtGASA6的表达水平。
　　本研究通过生物信息学的方法在川桑基因组中鉴定到74个参与茉莉酸生物合成与信号转导途径的基因。结构域分析、系统发生分析、多序列比对分析、基因结构分析表明川桑中这些基因与已报道植物物种相比具有较高的保守性，暗示在川桑中它们可能发挥类似的功能。咬食和机械损伤处理下的转录组分析表明这两种处理方式下差异基因在前期、中期表达模式相近，在后期表现出更大的差异。在1h时间点，茉莉酸生物合成与信号转导途径基因被显著诱导，茉莉酸途径开启。其它激素途径基因的表达也在这两种处理方式下不同程度地被诱导。咬食、激素处理下的表达模式和酵母双杂交结果表明MnNINJAl除了参与茉莉酸信号途径外，还可以参与其它激素响应和生理过程。转基因实验表明异源表达川桑MnNINJAl和MnNINJAs对拟南芥中茉莉酸、水杨酸、脱落酸、生长素、赤霉素下游响应基因的表达水平都产生了显著影响。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 概述

1.2 植物激素茉莉酸的研究进展

1.3 植物基因的选择性剪切

1.4 桑树茉莉酸研究进展

1.5 结语

第二章 引言

2.1 研究目的及意义

2.2 主要研究内容

2.3 研究路线

第三章 桑树茉莉酸生物合成与信号转导途径基因的鉴定、克隆及生物信息学分析

3.1 材料与数据

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 总结与讨论

第四章 咬食和机械损伤处理下川桑的转录组分析

4.1材料与方法

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.4 总结与讨论

第五章 MnNINJAl及其剪切体MnNINJAs的功能研究

5.1 材料与方法

5.2 实验方法

5.3 结果与分析

5.4 总结与讨论

第六章 综合与讨论

1、川桑茉莉酸生物合成与信号转导途径基因的鉴定及生物信息学分析

2、咬食和损伤处理下川桑的转录组分析

3、MnNINJAl和MnNINJAs的功能研究

论文创新点

参考文献

附录

在读期间发表文章及参研课题

致谢