桑树花青素生物合成相关基因的鉴定及功能研究

摘要

花青素是一种重要的植物水溶性色素，广泛分布于多种植物体内，是形成植物花和果实颜色的主要色素。花青素不仅在植物自身生理生化活动中起到重要的作用，而且还具有抗氧化、抗炎症、抗肿瘤、调节血脂等多种生物学活性。
　　花青素在结构上属于类黄酮化合物，其生物合成属于类黄酮生物合成的一部分，这是一个复杂的合成途径，涉及众多合成基因和调控基因的参与。目前该途径已在一些模式植物中被阐明。
　　桑树是一种多年生木本植物，除了传统上作为家蚕的食物来源外，桑树还具有很多其它重要应用，包括生态保护、中医资源、营养保健等。其中桑椹因味道鲜美、营养价值丰富而备受人们青睐。花青素是桑椹中含量丰富的一种营养成分，且具有极高的生物学活性。目前已有超过11种花青素在桑树中被鉴定，含量最丰富的分别是矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-芸香糖苷。研究桑椹中花青素生物合成途径对促进果桑品质改良具有重要意义。
　　本研究利用生物信息学方法，从桑树全基因组数据库中鉴定了参与桑树花青素生物合成的相关基因，并对其进行生物信息学分析。同时，我们选取了两种不同果色的桑树栽培种材料，利用qRT-PCR研究了所鉴定得到基因在桑椹成熟过程中的转录水平变化，并利用Western blotting技术对关键基因所编码的蛋白表达情况进行了确定，同时结合UPLC技术鉴定和测量了桑椹成熟过程中花青素的种类和含量变化，研究了该过程中桑树花青素生物合成相关基因的表达水平与花青素含量之间的关系。通过构建植物表达载体，利用植物转基因技术，研究了桑树花青素生物合成关键基因的功能和启动子活性。本研究所获得研究结果如下:
　　1、桑树花青素生物合成相关基因的鉴定和信息学分析
　　利用生物信息学方法，我们在已测序的川桑基因组中鉴定得到9个花青素生物合成相关基因，包括两个CHS、F3H、F3'H和一个CHI、DFR、ANS，并且以川桑cDNA为模板成功克隆得到除ANS外的其他8个基因（我们在广东桑品种粤椹大10中克隆得到ANS基因）。在川桑基因组中没有鉴定到F3'5'H基因。基因结构分析表明，鉴定得到的9个基因全部含有内含子，内含子数目和位置与其他植物中报道的相应基因的结果相一致。
　　将鉴定得到的桑树花青素生物合成相关基因与其他植物中相对应的基因进行序列比对发现，除F3H2的序列相似性较低外（小于40％），其余8个基因的序列相似性都较高（65％到93％）。结构域预测和多序列比对分析表明这些基因所编码的蛋白质都具有保守的行使各自催化活性所需的结构域和活性位点。
　　在plantCARE数据库中对鉴定到的桑树花青素生物合成相关基因上游启动子序列进行转录调控位点预测，发现其主要分为三类，第一类是光响应元件，这也是存在数目最多的一类，如BoxⅠ、G-Box、ATCC-motif等;第二类是一些激素响应元件，如ABRE元件响应脱落酸反应、ERE元件响应乙烯反应、CGTCA-motif和TGACG-motif响应茉莉酸甲酯反应等;第三类是一些胁迫响应元件，如Box-W1响应真菌激发反应、HSE元件响应热胁迫反应、LTR元件响应低温胁迫反应等。此外，在F3'H1、DFR和ANS上游还分别发现了MBSⅠ和MBSⅡ元件，这是和类黄酮生物合成相关的MYB转录因子的作用位点，这也暗示桑树MYB转录因子作为花青素生物合成的调节基因对相关的结构基因起到调控作用。
　　2、不同果色桑椹成熟过程中花青素生物合成相关基因的表达分析
　　利用qRT-PCR技术研究了桑树花青素生物合成相关基因在川桑六个组织中的表达情况，结果表明这些基因的组织表达模式差别很大，同一基因家族的不同成员之间也表现出很大的差别，例如MnCHS1特异性的在雄花中表达，而MnCHS2主要在根和雌花中表达，并且MnCHS1的表达水平远高于MnCHS2; MnF3H1主要在根和雄花中表达，而MnF3H2却主要在茎、叶和雌花中表达;MnF3'H1特异的在根中表达，而MnF3'H2却在多个组织中都有表达。这种表达差异暗示了同一基因家族中不同成员之间的功能和调控上可能存在差异。在川桑六个组织中都没有检测到MnANS的表达，这与六个组织中都没有检测的花青素积累的结果相一致。
　　我们选取了两种不同果色的桑树品种（紫色果实的粤椹大10和白色果实的珍珠白），首先利用Southern blotting技术检测了花青素生物合成相关基因在川桑和这两种栽培桑中的拷贝数情况，结果表明这些基因在两种栽培桑中的杂交模式比较一致，并且其拷贝数比川桑中要多。然后我们利用qRT-PCR技术研究了桑树花青素生物合成相关基因在桑椹成熟过程中的表达情况，根据表达模式的差别将这些基因分为四类，其中TypeⅠ类基因包括CHS1、CHI、F3H1、F3'H1和ANS，其在大10中的转录水平随着桑椹的成熟而增加，但在珍珠白中几乎检测不到表达。对于花青素生物合成途径后期的两个关键基因DFR和ANS，我们通过制备其多克隆抗体，在蛋白水平上进一步检测其表达情况。Western blotting结果表明ANS的蛋白水平表达情况与转录水平相一致，但DFR却相反，其转录水平随着粤椹大10桑椹的成熟而下降，但蛋白水平却增加，由此我们推测DFR存在一种转录水平上的负反馈调节机制。
　　利用UPLC技术对粤椹大10和珍珠白桑椹成熟过程中的花青素成分进行了鉴定和定量，结果表明粤椹大10桑椹中的花青素主要为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-芸香糖苷，这与之前的研究报道相一致。花青素含量随着桑椹的成熟而增加，并且在成熟后期出现急剧的增加，其中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的增加更为明显。在珍珠白的整个成熟过程中都没有检测到花青素的存在。该结果与花青素生物合成相关基因的表达情况相一致。
　　之前关于桑树花青素鉴定的研究表明桑树中的花青素主要为矢车菊素类衍生物和少量的天竺葵素衍生物，本研究中鉴定到的桑树花青素也主要为矢车菊素类衍生物。分析植物花青素合成途径可以看出这些不同类型的花青素都是从共同的前体柚皮素合成而来的，在桑树的基因组中没有鉴定到F3'5'H基因，F3'5'H是合成翠雀素相关的基因，推测桑树中缺乏翠雀素可能是由于F3'5'H基因的缺失所致。另一方面，多序列比对分析表明桑树的MnDFR属于Asp类型的DFR，该类DFR不能有效的将二氢山奈酚转化成无色天竺葵素，所以导致桑树中的花青素主要为矢车菊素类衍生物。
　　3、桑树花青素生物合成相关基因的功能研究
　　我们利用植物转基因技术在拟南芥中对MnDFR的启动子活性进行分析，结果表明在正常生长的转基因拟南芥中，MnDFR的启动子只在其根部有活性，并且当黑暗处理时，其活性会降低，但是当进行高温处理后，可诱导其在叶片和叶芽处行使活性，这暗示MnDFR可能参与高温胁迫引起的反应。
　　同样地，我们将桑树花青素生物合成途径后期的两个关键基因MnDFR和MnANS转化到拟南芥中，观察其对拟南芥花青素累积的影响。结果表明与野生型相比，转基因拟南芥从开始抽薹起，其茎的基部表现出明显的红色。在茎的生长过程中，整个植株的茎都能表现出淡红色，并且这种表型变化在转MnANS的植株中更为明显。这可能是由于在花青素生物合成通路中，ANS是更下游的酶，所以其催化作用对花青素的合成能产生更直接的影响。
　　我们利用叶盘转化法，将除MnANS外的其余8个基因分别转入到烟草中，在烟草中实现目的基因的过量表达。结果表明转基因烟草的生长和表型并没有出现明显变化，但是对烟草花朵进行花青素提取与定量分析表明，与野生型相比，转基因烟草花朵中的花青素含量出现变化，其中转MnCHS1、MnCHS2、MnCHI和MnDFR烟草植株的花青素含量增加，转MnF3H1和MnF3H2的烟草植株花青素含量出现下降，转MnF3'H1和MnF3'H2的烟草植株的花青素含量没有明显变化。
　　本研究利用生物信息学方法从川桑基因组中鉴定得到9个花青素生物合成相关基因，信息学分析表明与其它植物中相对应的基因相比，这些基因在序列、结构、结构域、催化活性位点上都存在较高的保守性，暗示了其功能的一致性。在两种不同果色桑椹成熟过程中的qRT-PCR、Western blotting、 UPLC等实验表明鉴定得到的桑树花青素生物合成相关基因的表达水平与桑椹中花青素的积累密切相关，并且推测出桑树中F3'5'H基因的缺失和DFR的底物特异性是导致桑树花青素成分主要为矢车菊素类衍生物的原因。转基因实验表明异源表达桑树的花青素生物合成相关基因对烟草和拟南芥的花青素累积会产生影响，尤其是在拟南芥中异源表达MnDFR和MnANS能够明显改变其表型。本研究首次在分子生物学水平上全面研究了桑树花青素生物合成相关基因，解析了桑树花青素成分与生物合成相关基因之间的关系。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 概述

1．2 花青素的分布、结构及性质

1．2．1 花青素的分布

1．2．2 花青素的结构

1．2．3 花青素的理化性质

1．3 花青素的生物合成

1．3．1 花青素生物合成途径

1．3．2 花青素生物合成相关基因

1．4 花青素的生理功能及应用

1．4．1 花青素的生理功能

1．4．2 花青素的应用

1．5 桑树花青素研究进展

1．5．1 桑树花青素的分离鉴定

1．5．2 桑树花青素的生物学活性分析

1．6 结语

第二章 引言

2．1 研究目的及意义

2．2 主要研究内容

2．3 研究路线

第三章 桑树花青素生物合成相关基因的鉴定、克隆及信息学分析

3．1 材料与数据

3．1．1 材料

3．1．2 序列信息的获得

3．1．3 主要使用软件

3．1．4 主要使用试剂及溶液配制方法

3．1．5 主要使用仪器

3．2 实验方法

3．2．1 桑树花青素生物合成相关基因的鉴定

3．2．2 RNA提取及质量检测

3．2．3 cDNA第一链合成

3．2．4 花青素生物合成相关基因的克隆

3．2．5 花青素生物合成相关基因的多序列比对与系统发生分析

3．3 结果与分析

3．3．1 桑树花青素生物合成相关基因的预测

3．3．2 桑树花青素生物合成相关基因的克隆及信息学分析

3．3．3 桑树花青素生物合成相关基因上游转录调控位点分析

3．4 总结与讨论

第四章 桑树花青素生物合成相关基因的表达分析和花青素含量测定

4．1 材料

4．1．1 生物材料

4．1．2 主要使用试剂及溶液配制方法

4．1．3 主要使用仪器

4．2 实验方法

4．2．1 RNA提取及质量检测

4．2．2 cDNA第一链的合成

4．2．3 桑树基因组DNA提取

4．2．4 Southern blotting

4．2．5 荧光定量PCR(qRT-PCR)

4．2．6 DFR和ANS的原核表达、蛋白纯化和抗体制备

4．2．7 桑树蛋白质的提取

4．2．8 Western blotting

4．2．9 桑树花青素的提取及UPLC检测

4．3 结果与分析

4．3．1 花青素生物合成相关基因在川桑中的组织表达分析

4．3．2 花青素生物合成相关基因在三个桑树品种中的拷贝数分析

4．3．3 花青素生物合成相关基因在两种不同果色桑椹成熟过程中的表达分析

4．3．4 DFR和ANS的原核表达、蛋白纯化和抗体制备

4．3．5 ANS和DFR的Western blotting

4．3．6 桑椹花青素的提取和UPLC检测

4．4 总结与讨论

第五章 桑树花青素生物合成相关基因的功能研究

5．1 材料与试剂

5．1．1 生物材料

5．1．2 主要使用试剂及溶液配制方法

5．1．3 主要使用仪器

5．2 实验方法

5．2．1 MnDFR启动子-GUS报告载体的构建

5．2．2 转基因过表达载体的构建

5．2．3 农杆菌感受态细胞的制备和转化

5．2．4 烟草叶盘转化法

5．2．5 拟南芥浸花法转化

5．2．6 转基因植株中目的基因表达水平的检测

5．3 结果与分析

5．3．1 MnDFR启动子表达模式及受调控分析

5．3．2 桑树花青素生物合成相关基因的转基因载体构建

5．3．3 桑树ANS和DFR在拟南芥中的异源表达分析

5．3．4 桑树花青素生物合成相关基因在烟草中的异源表达分析

5．4 总结与讨论

第六章 综合与结论

论文创新点

参考文献

缩略词表

附录

在读期间发表文章及参研课题

致谢