甘薯IbPSY和IbSGR基因的克隆与功能分析

摘要

甘薯是我国重要的粮食作物，其块根颜色多样。紫肉甘薯块根富含花色素苷，而橙肉甘薯块根则富含类胡萝卜素。β-胡萝卜素作为类胡萝卜素的一种，对人体健康有着重要的作用，在人体维生素A的合成途径中，β-胡萝卜素能够作为其合成的前体物质，当机体缺乏维生素A时，适量补充β-胡萝卜素能缓解由维生素A缺乏引起的病症。此外β-胡萝卜素还是一种很好的抗氧化剂，能有效的抑制机体中自由基的产生。
　　本研究从橙肉甘薯品系渝薯11-10-97新品系中克隆了八氢番茄红素合成酶基因IbPSY，该基因是类胡萝卜素合成途径中的第一个关键酶基因。IbPSY基因编码区全长为1320bp，编码的蛋白质含有439个氨基酸。 IbPSY含有一个47个氨基酸的质体转运肽，将IbPSY蛋白与绿色荧光蛋白GFP融合，进行亚细胞定位分析，结果表明IbPSY蛋白定位于叶绿体中，这一结果与其他物种中PSY蛋白的定位情况一致，并且符合类胡萝卜素的合成场所就是质体这一事实。利用产类胡萝卜素的缺陷型工程菌进行功能验证实验，IbPSY能够弥补细菌β-胡萝卜素合成途径中的crtB的作用，使缺陷型工程菌能合成β-胡萝卜素。这表明，本研究所得到的IbPSY具有八氢番茄红素合成酶的功能。在拟南芥中超量表达IbPSY能显著提高拟南芥叶片中类胡萝卜素的含量。这再一次证实了本研究所获得的IbPSY就是编码八氢番茄红素合成酶的基因。
　　本研究从甘薯中克隆得到了编码滞绿蛋白的基因IbSGR，IbSGR编码区全长801bp,编码的蛋白质含有266个氨基酸，IbSGR含有一个52个氨基酸的质体转运肽。亚细胞定位结果显示IbSGR蛋白定位于叶绿体中，采用qPCR技术分析IbSGR在甘薯叶和茎中的相对表达量，结果表明IbSGR在成熟叶片中的表达量最高，其次是幼嫩的叶片和老茎，在幼嫩的茎中表达量最低。在叶片衰老的过程中，SGR能帮助植物快速降解叶绿素，所以这一表达模式与SGR的功能是相符的。超量表达IbSGR的拟南芥，其叶片中的叶绿素含量与野生型相比有显著的下降。这表明本研究所得到的IbSGR确实是甘薯中编码滞绿蛋白的基因。
　　利用BiFC技术证明了IbSGR与IbPSY能够发生相互作用，将IbSGR基因转入产β-胡萝卜素的工程菌中，工程菌的菌体颜色由橘黄色变成了白色，且HPLC并未检测到工程菌中有β-胡萝卜素的积累。超量表达IbSGR的拟南芥叶片中类胡萝卜素的含量与野生型相比有明显的下降。这说明IbSGR能与IbPSY相互作用并能抑制IbPSY的功能，调控植物体类胡萝卜素的积累。
　　本研究确证了克隆得到的IbPSY和IbSGR的确就是甘薯的PSY基因和SGR基因，并且初步证明了IbSGR能与IbPSY相互作用，进而调控植株中类胡萝卜素的积累。

目录

声明

第1章 文献综述

1.1 背景简介

1.2 甘薯的生产与应用

1.3 类胡萝卜素的功能及其生物合成

1.4植物中类胡萝卜素的合成调控

1.5 植物滞绿基因SGR

第2章 绪论

2.1 研究目的和意义

2.2 研究范围和内容

2.3 技术路线

第3章 材料与方法

3.1 植物材料

3.2 菌株和质粒

3.3 仪器和设备

3.4 试剂盒及试剂

3.5 常规方法介绍

3.6 IbPSY和IbSGR基因cDNA的克隆与分析

3.7 qPCR反应

3.8 IbPSY和IbSGR蛋白的亚细胞定位

3.9 双分子荧光互补（BiFC）

3.10 IbPSY和IbSGR在大肠杆菌中表达

3.11 转基因拟南芥材料的获得

第 4 章 结果与分析

4.1 IbSGRcDNA、IbPSY cDNA的获得和生物信息学分析

4.2 IbSGR蛋白与IbPSY蛋白的亚细胞定位分析

4.3 IbPSY和IbSGR的功能验证

4.4 IbSGR与IbPSY关系的初步探索

第 5 章 结论与展望

5.1 结论与讨论

5.2 展望

参考文献

附录

缩略词表

硕士期间发表的论文

致谢