丹参多酚酸盐联用泼尼松治疗胶原诱导性关节炎(CIA)对大鼠骨代谢的影响

摘要

[目的]：
　　建立模拟类风湿关节炎(RA)的Ⅱ型胶原诱导性关节炎(CIA)模型，探讨丹参多酚酸盐联用泼尼松治疗CIA对大鼠骨代谢的影响及其作用机制，为RA的治疗提供新思路，并为开发丹参多酚酸盐的新用途提供实验依据。
　　[方法]：
　　选用8周龄Lewis雌性大鼠46只，随机分出6只为正常对照(CON)组，其余40只用于造模。造模组每只鼠皮内多点注射1.5g/LⅡ型胶原乳剂0.4ml，1周后以相同方法、剂量加强免疫1次。正常对照组按相同方法注射0.05mol/L醋酸0.4ml。免疫4周后筛选出发生关节炎（关节炎指数评分≥4）的大鼠27只，随机分成CIA组(n=7);CIA+泼尼松组(n=7)，CIA+丹参多酚酸盐组(n=6)，CIA+泼尼松+丹参多酚酸盐组(n=7)。CON组和CIA组给予溶剂对照，泼尼松按4.5mg/kg/d灌胃，丹参多酚酸盐按20mg/kg/d腹腔注射，连续给药90d。所有大鼠在处死前d14、13和d4、3皮下注射钙黄绿素7 mg/kg进行体内荧光标记。实验结束时，处死大鼠取材，用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清Wnt信号通路抑制剂Dickkopf-1(DKK-1)、骨保护索(OPG)、可溶性核因子-κB受体活化因子配体(sRANKL)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介索-6(IL-6)和骨钙素(OCN)的浓度;取大鼠左侧胫骨、第4腰椎进行骨组织形态计量学检测;取左股骨进行骨密度、骨生物力学和micro-CT的检测，取第5腰椎进行骨密度的检测;取右踝关节进行组织病理学评分检查，右胫骨进行免疫组织化学染色检测DKK-1、OPG、RANKL、TNF-α、IL-6蛋白的表达;右股骨用免疫蛋白印迹法检测DKK-1、OPG、RANKL蛋白的表达。
　　[结果]：
　　1.与CON组相比，CIA组大鼠体重下降(P＜0.05&P＜0.01)。与CIA组相比，泼尼松(PDN)组治疗4w后体重开始下降(P＜0.05)，丹参多酚酸盐(Sal)组治疗12w后，体重增加（P＜0.01），联合用药组体重无明显变化(P＞0.05)。
　　2.与CON组相比，CIA组踩关节组织病理学评分明显升高(P＜0.01)，PDN组和联合用药组病理学评分明显降低(P＜0.01)，但Sal组病理学评分无明显变化(P＞0.05)。与联合用药组相比，Sal组病理学评分明显升高(P＜0.01)。
　　3.与CON组比较，CIA组第5腰椎(LV5)以及股骨各段的骨矿含量(BMC)和骨密度(BMD)均明显下降(P＜0.01)。与CIA组相比，单独用药组(PDN和Sal)的BMC和BMD均无明显变化(P＞0.05)。联合用药组股骨各段的BMC均明显增加(P＜0.01)，股骨近端的BMD增加(P＜0.05)。与联合用药组相比，PDN组整段股骨BMC降低(P＜0.05)，Sal组整段股骨与股骨远端的BMC均降低(P＜0.05)。
　　4.与CON组比较，CIA组股骨生物力学参数（弹性载荷、最大载荷、断裂载荷、刚度系数）均明显下降(P＜0.01)。与CIA组比较，PDN和Sal组各项参数均无明显变化（P＞0.05）。联合用药组最大载荷、断裂载荷、刚度系数均升高(P＜0.05&P＜0.01)。与联合用药组相比，单用PDN组最大载荷降低(P＜0.05)。
　　5.Micro-CT扫描的结果显示，与CON组相比，CIA组股骨远端连接密度(Conn.D)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨体积分数(BV/TV)均明显减少(P＜0.01)，结构指数模型(SMI)和骨小梁分离度(Tb.Sp)均明显增加(P＜0.01)。与CIA组相比，PDN组Conn.D.、Tb.Th、BV/TV均增加(P＜0.05&P＜0.01)，而SMI和Tb.Sp均减少(P＜0.05&P＜0.01); Sal组Tb.Sp减少(P＜0.05);联合用药组Conn.D.、Tb.N、BV/TV均明显增加(P＜0.01)，而SMI和Tb.Sp均减少(P＜0.05&P＜0.01)。与联合用药组相比，单用PDN组Tb.Sp增加(P＜0.05);单用Sal组Conn.D.、Tb.N、BV/TV减少(P＜0.05&P＜0.01)，而Tb.Sp明显增加(P＜0.01)。
　　6.骨组织形态计量学:
　　(1)与CON组比较，CIA组胫骨上段骨小梁面积百分数(％Tb.Ar)和骨小梁数目(Tb.N)均明显降低(P＜0.01)，而骨小梁分离度(Tb.Sp)、破骨细胞数目(Oc.N)、破骨细胞周长百分率(％Oc.S.Pm)、动态参数荧光周长百分数(％L.Pm)、骨矿化沉积率(MAR)、骨表面新骨形成率(BFR/BS)、骨转换率(BFR/BV)均增加(P＜0.05&P＜0.01)。与CIA组相比，PDN组％Tb.Ar、Yb.N均增加(P＜0.05&P＜0.01)，而MAR、BFR/BS均降低(P＜0.05&P＜0.01); Sal组MAR降低(P＜0.05），但其它参数无明显变化(P＞0.05）;联合用药组％Tb.Ar、Tb.N均增加(P＜0.01)，而MAR、 BFR/BS、BFR/BV均降低(P＜0.01）。与联合用药组比较，PDN和Sal组％Tb.Ar、Tb.N均降低(P＜0.05&P＜0.01)。
　　(2)与CON组比较，CIA组腰椎松质骨％Tb.Ar、Tb.Th、Tb.N均降低(P＜0.05&P＜0.01)，Yb.Sp明显增加(P＜0.01)，但动态参数无明显变化（P＞0.05）。与CIA组比较，PDN和联合用药组％Tb.Ar、Tb.N均增加(P＜0.05&P＜0.01)，但动态参数均无明显变化(P＞0.05); Sal组％Tb.Ar增加(P＜0.05)，但动态参数无明显变化(P＞0.05)。
　　(3)与CON组比较，CIA组大鼠胫骨中段皮质骨面积(Ct.Ar)、皮质骨面积百分数(％Ct.Ar)均降低(P＜0.01)，而骨髓腔面积百分数(％Ma.Ar)、骨内膜骨矿化沉积率(E-MAR)和骨内膜骨形成率(E-BFR/BS)均增加(P＜0.01)。与CIA组比较，PDN组％Ct.Ar和骨内膜动态参数均降低，而％Ma.Ar升高（P＜0.01）;联合用药组骨内膜动态参数降低(P＜0.01)，且Ct.Ar、％Ct.A高于泼尼松组(P＜0.05&P＜0.01)，而％Ma.Ar低于泼尼松组（P＜0.01）。
　　7.与CON组比较，CIA组IL-6、TNF-α、 sRANKL的血清水平升高（P＜0.05），sRANKL/OPG的比值明显升高(P＜0.01)，但DKK-1、OCN、OPG均无统计学差异（P＞0.05）。与CIA组相比，所有用药组sRANKL/OPG的比值均降低(P＜0.05&P＜0.01);此外，Sal组OCN和联合用药组OPG的血清水平升高(P＜0.05)。
　　8.免疫组织化学染色结果显示，与CON组比较，CIA组胫骨组织中TNF-α、RANKL和DKK-1的蛋白表达均增加(P＜0.05&P＜0.01)，RANKL/OPG的比值明显升高(P＜0.01），而IL-6和OPG的蛋白表达无明显变化（P＞0.05）。与CIA组比较，PDN组和联合用药组TNF-α、RANKL的蛋白表达以及RANKL/OPG的比值均明显下降(P＜0.01); Sal组RANKL蛋白表达、RANKL/OPG的比值均下降(P＜0.01)。
　　9.Western blotting结果显示，与CON组比较，CIA组股骨组织中DKK-1、RANKL的蛋白表达均增加(P＜0.01），RANKL/OPG的比值增加(P＜0.05)，而OPG的蛋白表达无明显变化(P＞0.05）。与CIA组比较，联合用药组RANKL蛋白表达以及RANKL/OPG的比值均下降(P＜0.05)，单独用药组DKK-1和RANKL的的蛋白表达无明显变化（P＞0.05）。与联合用药组比较，单独用药组RANKL/OPG的比值均增高(P＜0.05)。
　　[结论]：
　　1.CIA大鼠并发全身性骨质疏松，表现为松质骨和皮质骨的骨量明显减少、踝关节结构破坏、骨二维和三维结构严重破坏、骨密度降低、骨生物力学性能降低、骨质量下降。其发生机制可能与炎症因子(TNF-α、IL-6)、RANKL/RANK/OPG信号通路、Wnt信号通路有关。
　　2.单用泼尼松治疗可延缓CIA大鼠胫骨上段和腰椎松质骨的丢失，对踝关节和骨三维结构有所改善，但会加重胫骨皮质骨的骨丢失，不能提高骨密度和骨生物力学性能。其作用机制可能与抑制炎症因子TNF-α的表达和调控RANKL/RANK/OPG信号通路有关。
　　3.单用丹参多酚酸盐治疗可延缓CIA大鼠腰椎松质骨的丢失，但对胫骨松质骨和皮质骨的作用不明显，不能改善踝关节结构，也不能提高骨密度和骨生物力学性能。其作用机制可能与促进骨钙素(OCN)分泌，调控RANKL/RANK/OPG信号通路有关。
　　4.丹参多酚酸盐联用泼尼松治疗可延缓CIA大鼠胫骨上段和腰椎松质骨的丢失，明显改善踝关节和骨三维结构，提高骨密度和骨生物力学性能，作用效果比单独用药好。另外，还可以改善泼尼松加重胫骨皮质骨丢失。其作用机制可能与抑制炎症因子TNF-α的表达，调控RANKL/RANK/OPG信号通路有关。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 研究背景

1．2 研究目的

1．3 研究内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3 结果

4 讨论与小结

5 结论与展望

参考文献

综述 治疗类风湿性关节炎常用药物的研究进展

致谢

附录

在读期间的科研情况