TLR-MyD88-NFκB信号通路调控斑马鱼髓系应急造血机制研究

摘要

炎症是一个常见的病理过程，主要呈现“红、肿、热、痛”四大特征。它是一系列免疫细胞如粒细胞和巨噬细胞，参与调控的复杂生物学过程。炎症可由多种因素所介导，如化学辐射，外伤，或者感染等。如果损害仅发生在局部，局部血管内皮细胞会表达P-selection，E-selection等因子，吸引血液中粒细胞和附近的巨噬细胞以及树突状细胞到达受损部位。在炎症反应早期，到达受损部位的免疫细胞会释放各种炎症因子吸引更多的免疫细胞，产生级联放大的作用。随着炎症反应的进行，受损组织逐渐修复，炎症信号终止，免疫细胞逐渐恢复到稳态。如果局部损伤导致的感染未被完全清除，外源物质会随着循环系统感染机体的其他部位，从而导致炎症信号放大。此时机体产生大量的髓系细胞，这一过程被称作髓系应急造血。
　　髓系应急造血这一过程主要为粒细胞应急造血，只有在某些细菌比如小肠结肠炎耶尔森菌感染时才主要表现为单核细胞应急造血。病原微生物感染机体时，机体通过自身表达的模式识别受体（PRRs）识别病原体表达的病原体相关分子模式（PAMP），启动相关的信号通路调控免疫细胞的应答。模式识别受体以 Toll样受体（TLRs）为主，不同的Toll样受体可识别不同的细菌成分，如TLR4可特异性识别LPS，TLR3识别Poly I:C。Toll样受体被激活后，除TLR3外都要通过髓系分化因子88（Myeloid differentiation factor88）激活下游信号通路，磷酸化由IKK-α, IKK-β和 IKK-γ组成的核因子κB抑制激酶复合物（IKK complex），进而磷酸化IκB，使其对NFκB(P50和P65构成)的抑制作用被解除，导致NFκB入核，启动下游基因如tnfα，il1β的表达。除此之外，G-CSF—G-CSFR信号通路也参与了这一过程，主要是通过CCAAT增强子结合蛋白β（C/EBPβ）发挥作用。CCAAT增强子结合蛋白家族有多个成员，比如C/EBPα，C/EBPβ，C/EBPδ，C/EBPε。C/ebpα缺失的突变体中粒细胞被阻断在多能前体阶段，稳态条件下粒细胞显著减少。而C/ebpβ缺陷的小鼠只会影响粒细胞应急造血，而对稳态中粒细胞数目并没有影响。在髓系应急造血这一过程中，髓系细胞的应答调控仍然存在许多问题，有待进一步研究。
　　斑马鱼（Danio rerio）是近年来新兴的一种模式生物，可用于大规模的遗传诱变筛选。由于其早期胚胎发育透明，可用于研究血液细胞的发育过程。此外，与哺乳动物一样，它既具有先天免疫也具有获得性免疫，但是在早期只有先天免疫。我们将内毒素LPS注射到2dpf(受精后2天)的斑马鱼血液中，能够引起机体系统性的炎症，粒细胞和巨噬细胞都会大量增加。LPS是TLR4的特异性配体，TLR4被LPS激活后，招募适配体分子MyD88，活化NFκB激活下游炎症因子，比如il1b， gcsf，tnfα等。于是我们在 myd88-/-中注射 LPS，结果表明髓系应急造血被抑制。Tg(NFκB：GFP)转基因鱼注射LPS后，绿色荧光明显增强，6hpi(注射后6h)达到最大值，并一直持续约24小时。NFκB的抑制剂Jsh-23处理后，与对照相比，发现粒细胞和巨噬细胞都明显减少。随后通过qPCR检测不同的炎症因子的表达水平，发现il1b变化明显。为探究il1b在髓系应急造血中的作用，过表达il1b，髓系应急造血增强；而il1b morphonlino敲降后，髓系应急造血被抑制。文献报道C/ebpβ参与到髓系应急造血，为了探究C/ebpβ是否也参与了LPS诱导的髓系应急造血。我们用LPS处理C/ebpβ突变体，发现粒细胞的扩增完全被阻断并且巨噬细胞扩增明显低于野生型。为了探究C/ebpβ和NFκB的关系，myd88突变体和NFκB抑制剂处理后，注射 LPS，C/ebpβ的表达明显下调；但是在白细胞中过表达 C/ebeβ后，髓系应急造血会被增强。我们的初步结果表明，LPS刺激诱导的髓系应急造血中， TLR信号通路的MyD88会激活NFκB，产生炎症因子，如il1b，进一步激活下游的信号通路。在这一过程中，C/ebpβ表达也上调，并且参与到LPS诱导的髓系应急造血。

目录

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英文缩略词简表

第一部分：文献综述

1.1 炎症的特点

1.2 炎症细胞的聚集

1.3 炎症的清除

1.4 胚胎造血发育

1.5 髓系应急造血

1.6 模式识别受体

1.7 Toll样受体及其信号通路

1.8 IL1β的活化

1.9 斑马鱼造血及其优势

第二部分：材料与方法

2.1 实验动物

2.2 实验仪器

2.3 实验材料和耗材

2.4 基因组DNA提取

2.5 cDNA第一链合成

2.6 荧光实时定量PCR

2.7 目的片段扩增

2.8 PCR产物回收

2.9 质粒转化，扩增与鉴定

2.10 RNA 探针的制备

2.11 全胚原位杂交

2.12 苏丹黑染色

2.13 PH3染色

2.14 斑马鱼胚胎显微注射

第三部分：实验结果

3.1 LPS诱导的斑马鱼髓系应急造血模型

3.2 髓系应急造血在myd88-/-被抑制

3.3 myd88-/-中巨噬细胞的增殖和凋亡

3.4 髓系应急造血中NFκB被激活

3.5 il1b参与髓系应急造血的应答

3.6 C/ebpβ表达在MyD88-NFκB信号阻断后下调

3.7 C/ebpβ参与髓系应急造血的应答

第四部分：讨论与分析

参考文献

致谢

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