家蚕丝腺组学分析及丝腺表皮蛋白功能研究

摘要

家蚕是重要的鳞翅目模式昆虫，因其重要的生物学价值和经济价值而被人们广泛研究，并已有比较清楚的遗传学背景。家蚕丝腺拥有精巧的生物学构造和强大的蛋白合成与分泌功能，这些生物学特性是家蚕合成蚕丝并实现其重要价值的基本前提。然而，截至目前，决定家蚕丝腺特异性构造以及蛋白合成和分泌的分子机理仍未被全面揭示，这严重影响了家蚕作为模式昆虫的应用范畴，严重制约了人们改良蚕丝属性和培育高产家蚕品种的效率，严重阻碍了家蚕生物反应器的实践进度以及家蚕在医疗、美容、材料等领域的应用进程。本研究即是围绕这一科学问题展开的。 本研究着眼于家蚕丝腺合成和分泌蛋白的分子机理和时空调控机制，采用转录组学、蛋白质组学、Western Blot、荧光定量PCR技术等分子生物学策略对家蚕丝腺进行了系统研究，以期获得充分的基因转录和蛋白表达数据，为家蚕丝腺相关研究提供重要的理论支持和完善的数据支撑。本研究获得以下主要结果。 1.采用RNA-Seq等方法对雌雄家蚕丝腺不同区段转录组进行了系统分析 本研究测定了5龄3天雌雄家蚕丝腺前部、中部前区、中部中区、中部后区和后部丝腺的转录组数据（SRA accession number:PRJNA284192），发现在测定的丝腺10个样品中，至少在1个样品有表达的基因共有7419个；其中，在雌雄家蚕前部丝腺中有表达的基因分别为5339个和5592个。前部丝腺相对于其他部位在雌雄家蚕中均上调表达的基因282个，对它们进行功能分析发现，这些基因的功能主要集中到氢离子转运、表皮蛋白合成、丝氨酸蛋白酶抑制剂合成和糖酵解等方面。研究表明，离子转运的发生是丝蛋白在前部丝腺发生构象转变的重要前提，这个过程是由ATP驱动的耗能过程，而前部丝腺鉴定到的糖酵解相关蛋白为这一过程提供了必要的ATP。表皮蛋白可能参与构成了丝腺的表皮层，而丝氨酸蛋白酶抑制剂则保护丝蛋白在丝腺贮存过程中不被降解。 2.采用LC-M S/M S等技术对家蚕丝腺不同区段蛋白质组进行了系统鉴定 本研究检测了5龄3天家蚕丝腺前部、中部前区、中部中区、中部后区和后部丝腺的蛋白质组数据，在丝腺前部、中部前区、中部中区、中部后区和后部丝腺中分别鉴定到了1615、2060、2139、2105和2132个蛋白质。其中，有1078个蛋白质是在5个区段中都被鉴定到的共有蛋白质，5个丝腺区段中特异高量表达的蛋白质数分别为364、181、117、138和344个。通过比较蛋白质组分析和GO分析，发现前部丝腺中拥有很多特异表达的蛋白质，主要包括表皮蛋白、离子通道蛋白和糖酵解蛋白这3大类，这个结果和转录组分析结果一致。推测这三个通路在丝蛋白构象转变和丝纤维形成过程中均发挥巨大的作用。 3.利用qRT-PCR等技术研究了家蚕丝腺表皮蛋白的种类、分布和功能 本研究结合家蚕转录组和蛋白质组数据，筛选到在5龄3天家蚕前部丝腺特异高量表达的56个表皮蛋白。染色体位置分析发现，32个表皮蛋白基因串联分布于三条染色体的四个区段。这四群表皮蛋白的序列同源性很高，暗示它们是通过基因复制进化而来的。在转录水平上，42个表皮蛋白在前部丝腺的表达量比在丝腺其它区段中的表达量高100倍以上；在蛋白水平上，19个表皮蛋白只能在前部丝腺中检测到，而在丝腺其它区段中检测不到。通过家族保守性分析发现，这56个表皮蛋白中，有31个属于CPR家族；其余25个包含14个CPH家族、5个CPAP家族、3个CPG家族、2个CPT家族和1个Chitin_bind_3家族。由于CPH和CPG家族的保守基序很短，我们对其中的基因进行了保守基序的提取和重新命名，新发现了8个新的表皮蛋白家族，为揭示不同家族的表皮蛋白在丝腺中的分工和协同进化奠定了基础。 4.采用Western Blot等技术研究了家蚕丝腺特异基序表皮蛋白的功能 本研究采用Western Blot技术测定了4个表皮蛋白CPR90、CPR68、CPAP3-G和C PAP3-J在5龄3天的表达情况，以及4龄到5龄的动态表达规律，进一步证实 CPR家族的表皮蛋白在4龄和5龄的食桑期高量表达，在眠期表达量很低；CPAP家族的表皮蛋白表达情况却与CPR家族的表皮蛋白不同，而是在眠期表达量更高，但到了食桑期表达量迅速降低。利用免疫组化等技术对CPAP3-G在前部丝腺中的定位和时期动态表达规律进行了检测，结果发现CPAP3-G与几丁质具有相同的定位，表明其分布于几丁质层中；同时，CPAP3-G的时期表达规律与Western Blo t检测结果高度一致。研究还发现了家蚕丝腺中特异表达的8个CPAP蛋白，结合N C BI网站资源分析，获得这8个CPAP蛋白的结构域，并进一步命名（或归类）为CPAP3-I、CPAP3-G、CPAP3-H、CPAP1-Q、2个chitinases和2个chitin deacetylases。 结合本研究结果，本文就丝腺内表皮层在眠期的更新过程作出如下推断：CPR表皮蛋白是4龄前部丝腺主要的表皮蛋白，4龄前部丝腺中的几丁质层是完整的，进入4眠期之后，丝腺的几丁质层开始了降解和重生的更新过程，伴随着CPR表皮蛋白的含量迅速降低，CPAP表皮蛋白和含有 CPAP结构域的几丁质降解酶的含量急剧提高，几丁质被降解为中间代谢产物，CPR蛋白也被蛋白水解酶所降解。在5龄早期，几丁质中间代谢产物在一系列酶的催化下又重新生成了几丁质，和新表达的CPR表皮蛋白结合在前部丝腺的腔内生成了新的表皮层，与此同时，完成使命的C PAP蛋白也逐渐被降解，前部丝腺内表皮层也就完成了在眠期的更新过程。

目录

声明

第1章 文献综述

1. 1 概述

1. 2 家蚕丝腺及蚕丝蛋白

1. 3 家蚕丝腺表皮蛋白

第2章 引言

2. 1 研究意义及立项依据

2. 2 本论文主要研究内容

2. 3 本研究主要技术路线

第3章 家蚕丝腺转录组测序及分析

3. 1 材料与方法

3. 2 结果与分析

3. 3 讨论与结论

第4章 丝腺的蛋白质组分析

4. 1 材料与方法

4. 2 结果与分析

4. 3讨论与结论

第5章 丝腺表皮蛋白的鉴定与分析

5. 1材料与方法

5. 2 结果与分析

5. 3讨论与结论

第6章 家蚕RR基序与CP AP基序表皮蛋白在丝腺中的功能研究

6. 1 材料与方法

6. 2 结果与分析

6. 3讨论与结论

第7章 综合与结论

7. 1 组学分析揭示了前部丝腺在丝蛋白构象转变过程中的重要作用

7. 2 前部丝腺高量特异表达的表皮蛋白的鉴定与分析

7.3 CPAP基序表皮蛋白的功能研究

本研究的创新点

参考文献

附表

博士期间发表和待发表的文章

博士期间主持及参与的项目

致谢