利用TeT-on系统构建可调控突变型淀粉样前体蛋白基因APPswe表达的神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞模型

摘要

[目的]
　　构建可调控β淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein，APP)基因突变体APPswe表达的慢病毒表达载体（pTetIIP-APPswe-Flag），并将其感染人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞，建立受强力霉素(Doxycycline，Dox)调控表达APPswe的SH-SY5Y细胞系，为阿尔茨海默病发病的分子机制研究、病理机制研究及以APP与淀粉样蛋白(β-amyloidpeptidcs，Aβ)作为靶向治疗位点的药物活性分子筛选提供一种稳定的细胞模型。
　　[方法]
　　1.应用PCR技术，以含有APPswe全长cDNA质粒为模板，设计含有AgeⅠ、EcoRI酶切位点的引物扩增编码APPswe全长的cDNA片段，经AgeⅠ、EcoRⅠ双酶切后插入Tet-On调控的慢病毒表达载体（pTetIIP-Flag）的AgeⅠ、EcoRⅠ酶切位点，构建pTetIIP-APPswe-Flag重组质粒。
　　2.构建的质粒(pTetIIP-APPswe-Flag)转染293T细胞，收集、浓缩慢病毒，再感染SH-SY5Y细胞，嘌呤霉素(Puromycin)筛选得到单克隆细胞株，同时通过western blot检测标签蛋白Flag的表达来验证细胞株的稳定性。
　　3.实验分SH-SY5Y细胞组、SH-SY5Y-APPswe细胞组及Dox+SH-SY5Y-APPswe细胞组，在细胞生长48 h、96 h、144 h时，收集细胞，免疫组化检验Tet-on系统调控SH-SY5Y细胞模型表达APPswe的情况。
　　4.实验分SH-SY5Y细胞组、SH-SY5Y-APPswe细胞组及Dox+SH-SY5Y-APPswe细胞组，在细胞生长48 h、96 h时，收集细胞，western blot检验Tet-on系统调控SH-SY5Y细胞模型表达APPswe的情况。
　　[结果]
　　1.经PCR、基因测序成功构建pTetIIP-APPswe-Flag重组慢病毒载体。
　　2.嘌呤霉素筛选72 h后，Western blot检测表明，在Dox诱导下，SH-SY5Y-APPswe细胞，Flag标签蛋白表达明显，表明转染成功，且APPswe的表达受Dox的调控。
　　3.免疫组化表明Dox+SH-SY5Y-APPswe细胞组，在Dox诱导48 h后蛋白表达增加，撤掉Dox，再培养48 h后，APPswe表达减小。Western blot结果表明Dox+SH-SY5Y-APPswe细胞组，在Dox诱导48 h后APPswe表达量比SH-SY5Y细胞组和SH-SY5Y-APPswe细胞组高(p＜0.05)，说明该细胞模型受Dox诱导，具有可调控性。
　　[结论]
　　成功构建受Dox调控表达APPswe的SH-SY5Y细胞模型。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 研究背景

1．2 研究目的

1．3 研究内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3 结果

4 讨论

5 小结

参考文献

综述 β-淀粉样蛋白与阿尔茨海默病

致谢

附录

在读期间的科研情况