沉默survivin基因后的转录水平和转录后水平机制的初步探讨

摘要

【目的】 根据本课题组早期结果，选择对survivin内含子3沉默效果最好的干扰重组质粒PGP-U6-GFP-neo-survivin-shRNA4（重命名为survivin-shRNA），转染HeLa细胞，检测沉默survivin基因后对survivin前体mRNA（hnRNA）表达、细胞活性、细胞动力、细胞增殖能力和Caspase-3活性的影响，并对启动子区域组蛋白特定位点赖氨酸残基甲基化和乙酰化水平变化进行研究。初步探索RNAi沉默survivin基因后转录水平和转录后水平的机制。 【方法】 survivin-shRNA、与survivin无关的阴性对照质粒shNC转染HeLa细胞，实时荧光定量PCR技术检测转染后survivin hnRNA的相对表达量，MTT法检测细胞活性的变化，细胞划痕实验检测对细胞迁移能力的影响，平板克隆形成实验用来检测细胞克隆形成率，Caspase-3活性活性测定检测沉默survivin后Caspase-3活性的变化，利用非变性染色质免疫沉淀技术检测survivin启动子区域组蛋白特定位点甲基化和乙酰化变化水平。 【结果】 1.实时荧光定量PCR结果显示：survivin hnRNA相对表达量明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）。 2.MTT结果显示：从第三天开始转染组细胞增殖能力低于两对照组，差异有统计学意义（P<0.05），但两对照组组间一直无明显差别，差异无统计学意义（P>0.05）。 3.细胞划痕实验结果表明：抑制survivin后，细胞的迁移率明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）。 4.平板克隆形成实验结果显示：细胞克隆形成率明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）。 5.Caspase-3活性检测结果表明：转染组Caspase-3活性明显增高，差异有统计学意义（P<0.01）。 6.非变性染色质免疫沉淀结果显示：survivin启动子区域组蛋白特定位点H3K9二甲基化水平明显增高，H4K16乙酰化水平明显减低，而这些改变均与基因沉默呈正相关。 【结论】 本研究确证了针对内含子设计的干扰重组质粒survivin-shRNA可以有效降低hnRNA的表达；诱导启动子区域组蛋白特定位点H3K9二甲基化水平增高，H4K16乙酰化水平降低，证明针对survivin内含子区域设计的干扰质粒能影响基因组蛋白的共价修饰，在转录水平沉默基因表达。结合前期实验结果和本次细胞活性、细胞动力、细胞增殖能力和 Caspase-3活性检测结果，验证了survivin-shRNA可以在转录后水平沉默基因。充分证明内含子并非是“无意义”的结构，在基因表达的过程中同样发挥重要作用，为利用 RNAi沉默靶基因提供了新思路。

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1 前言

1.1 研究背景

1.2 研究目的

1.3 研究内容

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果

3.1 shRNA重组质粒的测序鉴定

3.2 转染结果

3.3qPCR检测survivin hnRNA的相对表达量

3.4 survivin-shRNA对H3K9和H4K16特定位点的甲基化和乙酰化修饰的影响

3.5 MTT检测细胞活性结果

3.6 Caspase-3活性测定结果

3.7 划痕实验结果

3.8 平板细胞克隆形成实验结果

4 讨论

5 小结

参考文献

综述:RNA干扰技术的研究进展及发展前景

致谢

附录一： 缩写词中英文对照

附录二：在读期间的科研情况