自噬在脂多糖诱导小鼠急性肺损伤中的作用及其机制研究

摘要

【目的】 1.观察脂多糖腹腔注射小鼠造成的急性肺损伤模型自噬水平及炎症指标的变化； 2.通过药物3-MA干预自噬，观察给药组小鼠自噬水平及炎症指标的变化； 3.初步探讨自噬在急性肺损伤中的作用及其可能的机制。 【方法】 1.急性肺损伤小鼠模型的建立及给药 SPF级雄性BALB/c小鼠，8周龄，体重（20±2）g作为实验动物。将小鼠随机分为五组：正常组（Control组）、模型组（LPS组：LPS15mg/kg）、3MA对照组（3MA组：3MA20mg/kg），3MA低剂量组（LPS+3MA-L组：LPS15mg/kg+3MA20mg/kg）和3MA高剂量组（LPS+3MA-H组：LPS15mg/kg+3MA40mg/kg）。除Control组与3MA组外，其余各组小鼠腹腔注射LPS复制急性肺损伤模型；3MA组和低、高剂量组小鼠分别于急性肺损伤模型前60min，腹腔注射液相应剂量的3MA。观察各组小鼠情况，6小时后用1%戊巴比妥钠麻醉。 2.检测方法及各项指标的测定 眼科剪刀剪开胸腔，暴露心脏，用肝素化的1ml注射器抽取左心室的血液，将抽取的左心室动脉血即刻用全自动血气分析仪进行PaO2，PaCO2，pH的检测。取各组小鼠下肺组织右侧中下叶测定肺组织干湿重比（W/D）；左上肺叶部分用10%中性福尔马林溶液固定，HE染色观察各组小鼠肺组织病理情况；免疫组化法检测肺组织巨噬细胞F4/80的表达情况；TUNEL染色法检测肺组织细胞凋亡情况；右上肺及左下肺组织取出后置入1.5ml EP管，-80℃保存，使用MPO测试盒测定肺组织匀浆中MPO活力，Western blot法检测肺组织LC3BⅡ/Ⅰ、LAMP-2、TNF-α、NF-κB p65、Cleaved-Caspase-3蛋白表达水平。 【结果】 1.与Control组相比：LPS组小鼠PaO2值降低，有统计学意义（P<0.01），pH值降低，有统计学意义（P<0.01），PaCO2值上升，有统计学意义（P<0.01）；肺组织湿干重比值（W/D）上升，有统计学意义（P<0.01）；病理切片显示：肺间隔增厚、肺间质水肿及肺泡腔出血、肺泡塌陷、大量炎性细胞浸润明显，肺组织病理评分升高，有统计学意义（P<0.01）；MPO活力升高，有统计学意义（P<0.01）；肺间质巨噬细胞浸润明显增加，有统计学意义（P<0.01）。Western Blot结果显示：与Control组相比，LPS组LC3BⅡ/Ⅰ、LAMP-2蛋白表达水平上升，有统计学意义（P<0.01）；TNF-α、NF-κB p65、Cleaved-Caspase-3蛋白表达升高，有统计学意义（P<0.01）。TUNEL荧光染色结果显示：肺组织细胞凋亡明显增强，有统计学意义（P<0.01）。 2.与LPS组相比：LPS+3MA-L组PaO2值上升，有统计学意义（P<0.05），pH值上升，有统计学意义（P<0.05），PaCO2降低，有统计学意义（P<0.05）；肺组织湿干重比值（W/D）降低，有统计学意义（P<0.05）；病理切片显示：肺泡结构完整、肺间隔明显，病理学评分降低，有统计学意义（P<0.01）；肺组织MPO活力值降低，有统计学意义（P<0.05）。肺间质巨噬细胞浸润明显减少，有统计学意义（P<0.01）。Western Blot结果显示：LPS+3MA-L组LC3BⅡ/Ⅰ、LAMP-2蛋白表达水平降低，有统计学意义（P<0.05）；TNF-α、NF-κB p65、Cleaved-Caspase-3蛋白表达降低，有统计学意义（P<0.05）。TUNEL荧光染色结果显示：肺组织细胞凋亡明显减少，有统计学意义（P<0.05）。 3.与LPS组相比：LPS+3MA-H组PaO2值、pH值，PaCO2值变化不明显，病理切片结果，病理学评分降低不明显，肺组织湿干重比值（W/D）、MPO活力检测值、肺间质巨噬细胞浸润与LPS组接近，略呈下降趋势，无统计学意义。Western Blot结果显示：LC3BⅡ/Ⅰ、LAMP-2蛋白表达水平降低，有统计学意义（P<0.01）。TNF-α、NF-κB p65、Cleaved-Caspase-3蛋白表达差异不明显，略有降低趋势，无统计学意义。TUNEL荧光染色结果显示：肺组织细胞凋亡减少不明显，略有减少趋势，无统计学意义。 【结论】 1.脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤模型中，肺组织细胞自噬水平上调。 2.自噬抑制剂3-MA干预后，在一定程度上缓解肺损伤程度。 3.推测过度自噬在急性肺损伤中有加重损伤的作用。一定程度上抑制自噬可以起到保护肺组织的作用，其机制可能与细胞的高自噬水平通过激活NF-κB信号通路促进细胞凋亡从而加重肺组织损伤。

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1 前言

1.1 研究背景

1.2 研究目的

1.3 研究内容

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果

3.1各组小鼠行为学观察

3.2各组小鼠肺组织表面形态观察

3.3 各组小鼠血气分析的变化

3.4 各组小鼠肺组织湿干重比（W/D）的变化

3.5各组小鼠肺组织病理学评分

3.6 各组小鼠肺组织髓过氧化物酶MPO活力值变化

3.7 各组小鼠肺组织巨噬细胞的变化

3.8 各组小鼠肺组织自噬相关蛋白LC3B、LAMP-2的变化

3.9各组小鼠肺组织TNF-a、NF-κB p65、Cleaved-Caspase3的蛋白表达

3.10各组小鼠肺组织TUNEL荧光染色的变化

4 讨论

4.1 急性肺损伤模型的复制

4.2 急性肺损伤小鼠肺组织细胞自噬水平的变化

4.3 自噬在急性肺损伤小鼠模型中的作用

4.4 自噬在急性肺损伤小鼠肺组织中可能发生的机制

5 小结

参考文献

综述:自噬在急性肺损伤中的研究进展

致谢

附录一： 缩写词中英文对照

附录二：在读期间的科研情况