穗花杉双黄酮对人骨髓间质干细胞成骨分化的影响及机制探讨

摘要

【目的】 1.研究穗花杉双黄酮对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响； 2.探讨JNK和p38信号通路在穗花杉双黄酮对体外培养的人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化机制中的作用； 3.研究穗花杉双黄酮对由地塞米松诱导的转基因Cy25型斑马鱼骨生成抑制作用的影响。 【方法】 1.体外培养的人骨髓间充质干细胞，给予完全培养基，观察细胞增殖情况；给予成骨分化诱导液，通过碱性磷酸酶染色和茜素红染色观察人骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化、矿化的情况。 2.根据不同浓度穗花杉双黄酮处理分组：空白组，0.1μmol/L穗花杉双黄酮组，1μmol/L穗花杉双黄酮组，5μmol/L穗花杉双黄酮组，10μmol/L穗花杉双黄酮组。应用MTT法检测各组细胞在给药后培养1天，2天，3天，7天，14天的细胞活力。 3.根据不同浓度穗花杉双黄酮处理分组：空白组，诱导组，0.1μmol/L穗花杉双黄酮组，1μmol/L穗花杉双黄酮组，5μmol/L穗花杉双黄酮组。在诱导培养的第7天进行碱性磷酸酶染色以及碱性磷酸酶活性定量以检测细胞的分化情况，在第14天进行茜素红染色及钙结节定量以观察细胞的矿化情况。 4.以最佳成骨分化浓度的穗花杉双黄酮与JNK或p38 MAPK信号通路抑制剂对人骨髓间充质干细胞进行干预，实验分组为：诱导组、穗花杉双黄酮组、抑制剂组、穗花杉双黄酮+抑制剂组。 （1）先给予JNK或p38通路抑制剂阻断人骨髓间充质干细胞该通路的成骨分化过程，1 h后给予成骨分化最佳浓度的穗花杉双黄酮，分别培养7天及14天后应用碱性磷酸酶染色及碱性磷酸酶活性定量和茜素红染色及钙结节定量检测人骨髓间充质干细胞成骨细胞分化和矿化的程度，分析通路抑制剂是否影响穗花杉双黄酮对人骨髓间充质干细胞的促成骨分化和矿化作用。 （2） Western blot技术检测磷酸化JNK和p38表达水平。 （3） Western blot技术检测Runx2和Osx蛋白表达水平。 5.将培养24 h并鉴定为表达绿色荧光蛋白的转基因Cy25型斑马鱼受精卵分组为：空白组、地塞米松组、地塞米松+不同浓度穗花杉双黄酮药物组（0.1μmol/L、1μmol/L、5μmol/L）。每天半量换液至第9天，在激光共聚焦扫描显微镜下拍摄斑马鱼头部荧光图片，经Image Pro Plus6.0软件进行灰度分析计算斑马鱼头部的荧光面积及荧光累计光密度值，以估算斑马鱼头部的骨量和骨密度情况。 【结果】 1.在成骨分化诱导液作用下人骨髓间充质干细胞表现出成骨细胞特性：碱性磷酸酶染色阳性，茜素红染色可见特征性钙结节形成。 2.穗花杉双黄酮浓度在1μmol/L-10μmol/L范围内对人骨髓间充质干细胞的增殖有明显促进作用（P<0.01）。 3.0.1μmol/L-5μmol/L穗花杉双黄酮对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响： （1）穗花杉双黄酮促进人骨髓间充质干细胞的成骨分化，表现为碱性磷酸酶染色阳性，并呈浓度依赖性增加细胞碱性磷酸酶的活性（P<0.01）。 （2）穗花杉双黄酮促进人骨髓间充质干细胞的矿化，可剂量依赖性增加人骨髓间充质干细胞钙结节的形成（P<0.01）。 4.通路抑制剂SP600125和SB203580可阻断穗花杉双黄酮对人骨髓间充质干细胞成骨分化作用： （1）各抑制剂组与药物组比较，碱性磷酸酶染色和茜素红染色的颜色均较浅，抑制剂组碱性磷酸酶活性及钙结节定量均较药物组显著降低(P<0.01)； （2） Western blot分析磷酸化JNK和磷酸化p38表达水平，发现穗花杉双黄酮可使磷酸化JNK和磷酸化p38水平升高（P<0.05）；抑制剂SP600125和SB203580可阻断穗花杉双黄酮对JNK和p38磷酸化水平的升高作用(P<0.05)； （3） Western blot分析成骨标记转录因子Runx2和Osx蛋白的表达水平，发现抑制剂组Runt-related transcription factor2(Runx2)和osterix(Osx)蛋白表达水平较药物组显著下降(P<0.01)。 5.斑马鱼荧光分析结果显示，地塞米松组的荧光面积和荧光累计光密度值明显低于空白组（P<0.05），说明地塞米松可抑制斑马鱼骨形成作用；1μmol/L-5μmol/L浓度药物组的荧光面积和荧光累计光密度值(integrated optical density，IOD)与地塞米松组比较有显著性提高，表明穗花杉双黄酮可减轻地塞米松诱导的斑马鱼骨生成抑制作用。 【结论】 1.穗花杉双黄酮对人骨髓间充质干细胞的成骨分化有增强作用。 2. JNK和p38 MAPK信号通路参与穗花杉双黄酮对人骨髓间充质干细胞的成骨分化作用，其作用机制可能与上调转录因子Runx2和Osx的表达有关。 3.穗花杉双黄酮可减轻地塞米松诱导的斑马鱼骨生成抑制作用。