替诺福韦酯对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及其机制探讨

摘要

目的:
　　 通过检测替诺福韦酯(tenofovir disoproxil fumarate，TDF)对体外培养条件下人骨髓间充质干细胞（human mesenchymal stem cells-bone marrow，hBMSC）成骨分化的影响，及TDF干预下成骨谱系细胞Wnt/β-catenin信号通路相关因子的基因表达，探索TDF影响人骨代谢的机制。
　　 方法:
　　 第一部分1、人骨髓间充质干细胞体外培养与成骨分化诱导:体外培养人骨髓间充质干细胞，给予成骨分化培养基，观察细胞增殖和分化情况，应用碱性磷酸酶染色和钙茜素红染色检测人骨髓间充质干细胞成骨细胞分化的过程。2、TDF对人骨髓间充质干细胞成骨分化过程中细胞增殖和凋亡的影响:根据不同浓度TDF处理分组:0nM TDF组，50nM TDF组，500nM TDF组，5000nM TDF组。MTT法检测各组细胞在培养1-7天的增殖情况;用Annexin V&PI染色法和TUNEL法检测各组细胞凋亡情况。3、替诺福韦酯对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响:在诱导培养的第3、7、9、10天进行碱性磷酸酶染色，在第10、14、21、28天进行钙茜素红染色以检测各组细胞成骨分化过程中的矿化状况。4、替诺福韦酯对人骨髓间充质干细胞成骨分化过程中部分细胞因子基因表达的影响:应用realtime-PCR方法检测各组细胞中碱性磷酸酶、Ⅰ-型胶原、骨保护素和核因子κ B活化因子受体配体(receptor activator for nuclear factor-κB Ligand，RANKL)的基因表达水平;分析TDF干预下人源成骨谱系细胞分泌功能的变化。
　　 第二部分TDF影响人骨髓间充质干细胞成骨分化和功能的机制研究:细胞分组同实验二，应用realtime-PCR检测Wnt/β-catenin信号通路相关因子的基因表达水平，分析TDF对人成骨细胞分化和功能的影响是否通过Wnt/β-catenin经典信号介导，以及受TDF干扰的关键细胞因子。
　　 结果：
　　 第一部分1、人骨髓间充质干细胞经体外诱导培养可表现出成骨细胞特征:人骨髓间充质干细胞可经间充质干细胞-成骨分化培养基诱导表现出成骨细胞特性，碱性磷酸酶染色阳性、茜素红染色可见特征性钙结节形成。2、50nM-500nM TDF对hBMSC增殖和凋亡以及hBMSC分化的成骨谱系细胞增殖和凋亡无明显影响:①50nM TDF和500nM TDF对人骨髓间充质干细胞以及人骨髓间充质干细胞成骨分化过程中细胞增殖、凋亡无明显影响;②5000nM TDF显著抑制人骨髓间充质干细胞增殖，也抑制人骨髓间充质干细胞来源的成骨谱系细胞增殖。3、50nM-500nMTDF干扰hBMSC的成骨分化过程:①500nM TDF干扰人骨髓间充质干细胞的成骨分化过程，表现为碱性磷酸酶染色阳性细胞百分比减少（17.50±4.40％vs.12.40±2.70％，P=0.005），染色减弱;胞外基质矿化异常，茜素红染色钙结节多为条索状，边缘模糊，很少圆形、类圆形）;②50nM TDF对人骨髓间充质干细胞成骨分化过程中胞外基质矿化也有干扰，但作用弱于500nM TDF。4、TDF干扰hBMSC成骨分化过程中细胞因子的基因表达:在人骨髓间充质干细胞成骨分化过程中，50nMTDF(8.15±0.7 vs.6.89±0.35,P=0.001)和500nM TDF(8.15±0.70 vs.4.64±0.45,P=0.000)抑制碱性磷酸酶基因表达，也抑制Ⅰ-型胶原的基因表达(9.28±0.26 vs.2.81±0.17,P=0.000;9.28±0.26 vs.1.98±0.15, P=0.000);而RANKL mRNA在50nMTDF组（4.98±0.20 vs.7.89±0.41,P=0.00）和500nM TDF组(4.98±0.20 vs.6.82±0.03，P=0.000)表达水平均升高。
　　 第二部分50nM TDF和500nM TDF干扰人骨髓间充质干细胞成骨分化过程中LRP5 mRNA表达;50nM TDF(5.01±1.69 vs.2.31±0.24,P=0.001)和500nM TDF(5.01±1.69 vs.3.39±0.79，P=0.021)均降低β-catenin mRNA表达。
　　 结论：
　　 1、替诺福韦酯对人骨代谢的影响可能是通过抑制成骨细胞的分化过程以及成骨细胞功能实现的;
　　 2、Wnt/β-catenin经典信号通路参与介导替诺福韦酯对成骨细胞分化和功能的干扰作用，尤其是LRP5和β-catenin mRNA的异常表达可能起主要作用。

目录

缩略词表

摘要

前言

参考文献

第一部分 替诺福韦酯对人骨髓间充质干细胞成骨分化、功能、增殖和凋亡的影响

第一章 人骨髓间充质干细胞体外培养与成骨分化诱导

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

图表

第二章 替诺福韦酯对人骨髓间充质干细胞及其成骨分化过程中细胞增殖和凋亡的影响

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

图表

第三章 替诺福韦酯对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

图表

第四章 替诺福韦酯对人骨髓间充质干细胞成骨分化过程中部分细胞因子表达的影响

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

图表

参考文献

第二部分 替诺福韦酯影响人骨髓间充质干细胞成骨分化和功能的机制研究

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

图表

参考文献

结论

综述

附录

致谢

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