丙肝病毒核心基因靶向性M1GS核酶的优化及其活性研究

摘要

自1989年美国加州的Chiron 公司首先成功地从受感染的黑猩猩血液标本中克隆了丙肝病毒（hepatitis C virus，HCV）的cDNA 以来,对其关注和研究不断加强和深入。
　　 HCV 感染不仅是造成慢性肝病的主要原因,同时也是部分国家和地区肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC）的主要病因。目前全球HCV 感染者约有1.7亿,每年新增感染者达300万～400万。HCV 感染的慢性率高达70％以上,至今尚无有确切保护作用的疫苗问世,国际上公认的治疗方法a 干扰素联合利巴韦林持续应答率低下、副作用大且受HCV基因型限制，故迫切需要发展更有效的疗法控制HCV的感染和传播。
　　 大肠杆菌来源Rnase P是催化切割ptRNA 5＇端成熟的天然核酶，该酶的催化核心为一个377 nt的RNA 亚单位（M1RNA），能在具备高盐离子和适当Mg2＋的体外缓冲环境中对RNA 底物进行位点特异的切割。M1RNA 主要识别底物的二级结构，其最小的底物结构必须含有5'单链区和tRNA 氨基酸接受臂的双链茎-环结构。基于此，对于已知序列的靶基因mRNA，均可通过设计一小段引导序列（Guide Sequence，GS）与其互补结合，结合后的mRNA/GS 复合物类似于M1RNA 底物的二级结构，可被M1RNA 识别并特异切割，由此发展出的新型靶向核酶——即M1GS 核酶。
　　 本文选择HCV基因组中序列相对保守、且在病毒复制过程中起关键作用的核心基因（core gene，C）作为靶基因，对针对该基因mRNA的靶向性核酶M1GS-HCV/C167通过切割位点筛选、添加桥序列（Bridge Sequence）等手段进行优化，以提高其切割活性。
　　 通过胞外切割试验对M1GS 核酶的靶向切割活性进行研究，结果表明，经过优化的核酶M1GS-HCV/C52，M1GS-HCV/C141，其体外切割活性得到提高。初步探索了影响人工核酶M1GS 体外切割效果的因素，发现M1GS 核酶对底物RNA片段的体外切割受底物RNA 高级结构及底物与核酶的反应比例的影响。进一步的胞内实验，构建M1GS 核酶真核表达载体(pc-M1GS52、pc-M1GS141），并与HCV 核心基因真核表达载体(pc-HCV/core)共转染Huh-7细胞，以检测M1GS 核酶能否在胞内抑制靶基因的表达。通过RT-PCR 半定量和Western Blot，结果表明，优化后的M1GS 核酶在胞内可使靶基因mRNA的水平降低，同时能明显降低HCV核心蛋白的表达。
　　 通过本文的研究，成功将核酶M1GS-HCV/C167 进行了优化，初步摸索了影响切割反应的因素，使其胞内外的切割效率均得到提高，得到切割活性更高的核酶M1GS-HCV/C52及M1GS-HCV/C141，为今后更深入的研究提供的了实验素材并奠定了坚实基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

1 材料与仪器

2 实验方法

3 结果

4 讨论

参考文献

附录

致谢