无创性产前诊断遗传性疾病的生物芯片的研究

摘要

本文对无创性产前诊断遗传性疾病的生物芯片进行了研究。目的：建立具有实用价值的无创性产前诊断遗传病的生物芯片微型全分析系统，拟将胎儿有核红细胞的富集，胎儿遗传物质的扩增和遗传病诊断三个部分有机组合，实现整个分析过程的自动化、微型化，从而减少资源浪费和避免结果的污染。现阶段我们结合无创性产前诊断仅对样本制备、生化反应、结果诊断三个独立环节进行初步的研究和优化，具体目的是：1.样本制备方面，尝试在提高自孕妇外周血中富集胎儿细胞效率的同时，绕过仪器微型化中最难克服的离心问题，使胎儿细胞的富集过程易于实现自动化和微型化；2.生化反应方面，以非微加工形式构建芯片PCR的反应腔体，降低制作成本，使其与温控系统整合后更利于普及应用；3.结果检测方面，拟构建固相PCR(solidphase-PCR，SP-PCR)诊断芯片，并对芯片的构建条件进行系统优化。最终，以缺失型杜氏肌营养不良(Duchennemusculardystrophy，DMD)为模型，初步建立无创性产前诊断生物芯片的技术平台。 方法：1.建立孕妇外周血胎儿有核红细胞的高效富集系统：首先，建立孕妇外周血实验模型，以此模型确定合适的红细胞凝集剂浓度，比较抗体CD50和CD45在去除白细胞和富集有核红细胞(nucleatedredbloodcells，NRBC)方面的差异。然后，采用合适浓度的红细胞凝集剂和CD50抗体去除孕妇血中的白细胞和成熟红细胞，再用微加工制作的微型硅膜过滤芯片，以细胞直径的差异，进一步去除红细胞得到胎儿有核红细胞。最后，分别用模拟孕妇外周血和真实孕妇外周血比较新建方法和常用方法对NRBC的富集效率和白细胞/红细胞的清除率。 2.实现胎儿单细胞芯片全基因组扩增：借鉴原位PCR的密封圈和芯片实验室常用的玻片构建PCR芯片反应腔体，验证构建的腔体与PCR的材料相容性。利用优化的表面处理剂BSA浓度和所加酶量等条件确定扩增的检测底限。凝胶纯化后测定芯片单细胞全基因组的扩增产量，并以此为模板进行多种基因的再次扩增，初步验证产物的均匀性和可用性。 3.构建缺失型DMDSP-PCR诊断芯片：构建SP-PCR诊断芯片，利用人工合成的寡核苷酸进行原理验证实验；并对构建芯片片基上探针的耐热性、点样探针浓度、探针连接臂长度和探针固定的紫外交联强度等因素进行系统优化和选择。以缺失型DMD为模型，构建SP-PCR诊断芯片，同时构建DMD寡核苷酸芯片对SP-PCR芯片结果进行验证。最终用DMDSP-PCR芯片和寡核苷酸芯片检验一例DMD外显子13缺失的胎儿全基因组扩增产物。初步验证构建的SP-PCR芯片的临床实用性。 结果：1.样品制备部分：(1)通过连续浓度梯度实验，确定最适宜的红细胞凝集剂的浓度是2％，该浓度可使在成熟红细胞凝集的同时最大限度地避免NRBC的丢失。(2)采用CD50抗体比常用的CD45抗体可以减少10～15％的NRBC的损失率，二者具有相同的白细胞去除率。(3)新建的胎儿细胞富集方法的富集效率可达65％以上，而常用方法仅有不足30％，二种富集方法得到的有核细胞数均为105～6。真实孕妇外周血样本实验结果显示：新建富集方法较常用方法每份(10ml)平均多获得93.5个NRBCs。 2.生化反应部分：(1)由玻璃、塑料盖玻片、GeneFrame双面胶框组成的PCR芯片腔体内表面对反应没有抑制。(2)在构建的芯片PCR反应腔体内对简并寡核苷酸扩增条件进行优化后表明，反应体系中加入2.5UAmpliTaqGold酶及1.0％BSA时的扩增效果最好。(3)采用该体系实现了单细胞芯片的简并寡核苷酸扩增，扩增产物长度约在200-2000bp范围，扩增效率为101。利用该产物为模板可以再次进行多个基因的检测。 3.结果检测部分：(1)PLL玻片和醛基玻片对固定探针耐热性的比较显示PLL玻片好于醛基玻片，确定实验采用PLL芯片作为基片。(2)构建SP-PCR芯片的紫外交联、探针连接臂长度和探针点样浓度的最佳实验条件分别是180mJ、25个T和20μmol/L。(3)构建了检测DMD9个外显子缺失的SP-PCR芯片，并对一例DMD外显子13缺失的胎儿细胞进行准确诊断，其结果与寡核苷酸对照芯片及临床诊断完全一致。 结论：1.新建一种自孕妇外周血中富集胎儿有核红细胞的方法，该方法避免离心步骤，使用CD50抗体去除白细胞，采用微型硅膜过滤芯片过滤成熟红细胞，与常用方法相比具有高效、快速及易于实现微型化和自动化的优势。2.可以在非微加工形式的芯片PCR反应腔体中实现胎儿单细胞的全基因组扩增，扩增效率达101，扩增产物可以做为后续遗传学分析的模板。该腔体易于与温控系统整合为PCR芯片。3.根据优化的实验条件构建的缺失型DMDSP-PCR诊断芯片，将扩增与结果检测集为一体，提高了芯片检测的灵敏度，建立了SP-PCR诊断芯片的技术平台。4.分别对样品制备、生化反应和疾病诊断三部分进行了研究和优化，为产前诊断实验室的最终建立奠定基础。

目录

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英文缩写一览表

前 言

第一部分自母血中高效富集胎儿有核红细胞系统的建立

引 言

材料和方法

结 果

讨论

小 结

照 片1

照 片2

第二部分芯片单细胞全基因组扩增

引 言

材料和方法

结 果

讨论

小 结

第三部分DMD缺失型固相PCR诊断芯片的构建及应用

引 言

材料和方法

结 果

讨论

小 结

全文结论

致 谢

参考文献

文献综述一母血中的胎儿细胞

文献综述二生物芯片概述

第一部分　生物芯片的概述和分类

第二部分　DNA芯片简介

参考文献

博士研究生期间发表论文、参加会议及获得科研基金资助情况