甲胎蛋白启动子调控DTA基因表达对肝癌细胞靶向治疗的实验研究

摘要

背景和目的：白喉毒素对人与许多动物有剧毒，1-2个毒素分子进入细胞即可将其杀灭，白喉毒素A片段(diphtheriatoxinA，DTA)可使核蛋白体上的链延长因子2(elongationfactor2，EF-2)失活，抑制蛋白质合成，使细胞变性坏死。将DTA与单抗或其它能与肿瘤细胞特异结合的细胞因子等重组形成融合蛋白，能对一些表达特异蛋白的细胞产生杀伤作用。原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，发病隐匿，确诊时只有少数病人能满足手术条件，且手术切除复发率高，放疗和化疗敏感性低，免疫治疗和介入治疗效果均不理想。基因治疗是目前原发性肝癌的一个研究热点，利用细胞或组织特异性启动子能够使目的基因在特定的靶细胞中表达，从而最大程度地减少对正常组织的毒副作用。目前利用AFP(α-Fetoprotein，AFP)转录调控序列驱动目的基因表达是肝癌靶向治疗的主要手段[3-5]。本研究构建了含AFP启动子序列的DTA基因表达载体，转染体外培养的肝癌细胞，检测DTA表达及其对细胞的杀伤作用，为肝癌特异性基因治疗探索新的方法。 方法：1、根据人AFP基因图谱设计含有限制性内切酶KpnⅠ和HindⅢ位点的引物，选择性地从人基因组中扩增出人AFP启动子序列，测序验证，采用定向克隆的方法，将AFP启动子克隆到KpnⅠ和HindⅢ位点替换pS2-DTA中的SV40Promoter基因，构建新表达载体pAF-DTA。2、根据pEGFP-C3基因图谱设计含有限制性内切酶NcoⅠ和XbaⅠ位点的引物，选择性地扩增出EGFP基因序列，将EGFP定向克隆到NcoⅠ和XbaⅠ位点替换pAF-DTA中的DTA基因，构建新表达载体pAF-EGFP。3、研究中分试验组(AFP阳性肝癌细胞HepG2)和对照组(AFP阴性肝癌细胞SMMC7721及小鼠成纤维细胞NIH3T3)，用脂质体介导，转染pAF-EGFP质粒到培养的HepG2、SMMC7721、NIH3T3细胞，检测转染细胞荧光强度，了解AFP启动子驱动目的基因表达的能力。4、用脂质体介导，转染pAF-DTA质粒到HepG2、SMMC7721、NIH3T3细胞，通过RT-PCR和细胞免疫化学染色检测DTA的表达、TUNEL法检测细胞凋亡、台盼蓝拒染实验比较细胞存活率、细胞形态学等指标观察其对肝癌细胞的杀伤作用。 结果：1、对克隆的AFP启动子、EGFP片段PCR扩增产物进行电泳，分别在297bp、630bp处可见特异条带，表明AFP启动子、EGFP克隆成功，AFP启动子测序结果与Genbank公布的AFP启动子基因序列完全相同。2、pAF-DTA重组质粒经KpnⅠ、HindⅢ双酶切后，得到297bp的AFP启动子片段及3733bp的载体片段。pAF-EGFP重组质粒经NCOⅠ、XbaⅠ双酶切后，得到630bp的EGFP片段及3451bp的载体片段，表明连接成功。3、荧光检测结果表明：HepG2、SMMC7721、NIH3T3细胞转染pAF-EGFP质粒后，绿色荧光蛋白在AFP阴性细胞微量表达，而在AFP阳性肝癌细胞中高表达。3、HepG2、SMMC7721、NIH3T3细胞转染pAF-DTA质粒后观测到：(1)在AFP阳性肝癌细胞中细胞分裂相少见、存活率低且生长缓慢，对照细胞却很快进入对数生长期。(2)AFP阳性肝癌细胞中，DTA在mRNA和蛋白水平的表达量显著增加。(3)AFP阳性肝癌细胞凋亡指数比对照细胞显著增高(P＜0.01)。 结论：1、我们成功地克隆了AFP启动子。2、通过定向克隆成功地构建了含甲胎蛋白启动子序列和白喉毒素A链基因的真核表达载体。3、甲胎蛋白启动子有强烈的转录活性，可以促进增强型绿色荧光蛋白基因在AFP阳性肝癌细胞中高表达。4、pAF-DTA在AFP阳性细胞中高表达，产生选择性杀伤作用，抑制其生长。

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参考文献

文献综述白喉毒素及其抗肿瘤作用进展

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