干预代谢途径对缺血再灌注诱导肥大心肌细胞凋亡作用的研究

摘要

目的:近年来研究认为线粒体能量代谢在细胞凋亡中起到重要的作用,但其作用机制欠清楚,尤其是对于肥大心肌细胞凋亡及其能量干预影响鲜有报道.本研究引入改变糖代谢、脂肪代谢的试剂二氯乙酸盐(dichloroaceetate),抗霉素A(antimycin A)、曲美他嗪(trimetazidine)、L-肉碱(L-carnitine)等干预,研究其对缺氧-复氧致肥大心肌细肥凋亡作用的影响,试图阐明线粒体代谢途径的转变与肥大心肌细胞凋亡的关系,即干预代谢途径对肥大心肌细胞凋亡的调控作用.材料与方法:该研究采用胰酶分步消化法进行Wistar大鼠心肌细胞原代培养,用差速黏附技术加Brdu法除去非心肌细胞.采用特异性免疫细胞化学染色方法及电镜鉴定体外培养的心肌细胞,含血管紧张素AII10-7mol/L的培养基培养细胞48h诱导心肌细胞肥大.应用[<'3>H]-亮氨酸掺入测定心肌细胞蛋白质合成速率来检测心肌肥大及透射电镜观察肥大心肌细胞超微结构变化.以低氧饱和的低糖DMEM培养基置换原高糖DMEM培养基后,细胞放入37℃的3﹪氧气(3﹪O<,2>),5﹪二氧化碳(5﹪CO<,2>,),92﹪氮气(92﹪N<,2>,)孵箱中,在此缺氧条件下培养12h~48h,再放回原DMDM培养基5﹪CO<,2>,22﹪O<,2>孵箱中4h,通过体外缺氧、复氧的方式在细胞水平模拟心肌缺血再灌注损伤诱导细胞凋亡.用电镜鉴定凋亡细胞,用可与细胞核DNA结合的荧光染料Hoechst33342/PI双染法识别凋亡细胞,用TUNEL末端标记法研究凋亡规律,提取细胞DNA用琼脂糖凝胶电泳检测具有凋亡特征的DNA梯形带.用改变糖代谢的试制二氯乙酸盐、抗霉素A和改变脂肪代谢的试制曲美他嗪、L-肉碱等不同剂量干预,观察对缺氧/复氧不同时相点诱导体外培养肥大心肌细胞凋亡作用的影响.用SPSS10.0行统计分析.结果:1.原代培养的心肌细胞呈梭形、三角形及不规则形.其中,梭形细胞占培养细胞的80﹪左右,胞体呈细长的梭形,呈圆形,胞质折光性强,搏动明显.小鼠特异性抗大鼠a-心肌肌动蛋白免疫细胞化学染色,可见胞浆中大量棕红色丝状阳性着色,胞核不着色.2.与对照组比较,AngII组超微结构改变表现为:心肌细胞胞核及核仁增大,胞核形态不规则,染色质丰富,粒体肿胀,胞质中糖原及脂质沉着.这些改变符合代偿性细胞肥大表现.3.AngII组心肌细胞[<'3>H]-亮氨酸掺入较对照组明显增强,提示细胞肥大、蛋白质合成增强.4.单纯缺氧可导致体外培养的肥大心肌细胞凋亡,随着缺氧时间延长,凋亡率增加.5.缺氧/复氧可导致体外培养的肥大心肌细胞凋亡,缺氧/复氧比单纯缺氧更能促进心肌细胞凋亡.6.二氯乙酸、曲美他嗪、L-肉碱呈剂量依赖性明显降低细胞凋亡率(P<0.01).7.抗霉素A呈剂量依赖性明显升高细胞凋亡率(P<0.01).结论:1.采用胶原酶分步消化培养原代心肌细胞具有简便易行、细胞产量高、损伤小的优点,是研究心肌肥厚的细胞模型的重要手段和工具.2.AngII可明显促进心肌细胞增生及结构蛋白的生物合成,进而导致细胞发生肥大的病理改变.3.二氯乙酸、曲美他嗪、L-肉碱具有抗凋亡作用.4.抗霉素A具有促凋亡作用.5.上述研究证实,对肥大心肌细胞糖代谢和脂肪代谢途径的干预能达到调控细胞凋亡的作用.

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前 言

第一部分 Wistar大鼠乳鼠心肌细胞培养鉴定及肥大心肌细胞模型建立

第二部分 肥大心肌细胞凋亡模型的建立

第三部分 二氯乙酸盐、抗霉素A、曲美他嗪、L-肉碱对缺氧/复氧诱导肥大心肌细胞凋亡的作用

全文结论

致 谢

照 片

参考文献

文献综述 线粒体与心肌细胞凋亡

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