小鼠肾近曲小管上皮细胞顶侧膜钾通道的电生理学特性及环孢素A的影响

摘要

肾脏近曲小管钾离子通道在维持细胞膜电位、调节细胞体积以及维持水与电解质的重吸收和分泌等方面，均起着非常关键的作用，而且近曲小管是缺氧和中毒损伤最易发生的部位，因此，对肾脏近曲小管钾离子通道的研究具有较重要的生理学意义，目前尚未完全了解其生理学特性和功能。 环孢素A是临床器官移植中广泛使用的免疫抑制剂，但其严重的肾毒性限制了它的使用。其发病机制尚未完全明了，目前研究发现它不仅可引起血液动力学的改变，而且对肾小管有直接的损害作用，且与近曲小管密切相关。但对于近曲小管离子通道的改变研究涉及甚少。为此，本实验建立正常小鼠肾脏近曲小管上皮细胞原代培养体系，采用细胞贴附式、内面向外式膜片钳技术研究正常小鼠肾脏近曲小管上皮细胞顶侧膜K+通道的电生理学特性，观察免疫抑制剂环孢素A对K+通道特性的影响，探讨其可能的作用机制。 方法： 采取改良的胶原酶消化-密度梯度离心法进行小鼠肾脏近曲小管上皮细胞的分离及纯化，获得的近曲小管上皮细胞在DMEM培养基中进行单层培养。通过台盼蓝排斥法鉴定细胞活性；光镜、碱性磷酸酶染色观察细胞形态学改变；透射电镜观察其超微结构。 在原代培养的细胞和经环孢素A预处理(终浓度300ng/m1)的培养细胞上采用细胞贴附式、内面向外式膜片钳技术记录近曲小管顶侧膜K+通道电流进行分析比较。 主要结果： 1.采用改良的胶原酶消化-密度梯度离心法获得的细胞大小一致，活性＞95％；光镜下可见未贴壁细胞为圆形，胞体光滑，折光性好，直径约8.5～10.5μm；贴壁细胞呈梭形，透明度增大而折光性减弱，融合的单层细胞呈鹅卵石样铺满瓶底；碱性磷酸酶染色呈阳性；电镜检查见面向液层的刷状缘有微绒毛形成，细胞内可见丰富的线粒体、溶酶体。 2.小鼠肾近曲小管上皮细胞顶侧膜上的这种K+通道在多数膜片(61％)中自发性开放，无自发性开放的通道在牵张时可被激活。使用含有TTX、Cd2+的浴液S2灌流时仍能记录到这种通道。该通道表现为单一的电流幅度，在超极化状态下表现为内向电流，其斜率电导为25.5±0.4pS(钳制电压在20mV～60mV，n=8)，通道开放活动随极化程度的增大而增加。在去极化状态下表现为外向电流，并具有内向整流特性，其外向电流的弦电导为9.25±0.6pS(钳制电压在-40mV到-60mV,n=6)；在对称性钾浴液中该通道的翻转电位是4.2±1.3mV，内面向外式两侧不对称溶液(70mMbath/140mMpipette)时翻转电位在-15.1±3.5mV，Pk/PNa≈8∶1；该通道具有一个开放时间常数和两个关闭时间常数；开放概率与钳制电压依赖性不明显；通道的活动受细胞外液pH值的影响，随着细胞外液酸性增加(pH7.4～6.8)开放概率减小。 3.经CsA处理后记录到的K+通道电流幅度较之相同钳制电压下的正常通道差异不明显，其通道的Ⅰ-Ⅴ关系并没有因CsA处理的作用而发生位移或改变，但开放概率明显降低，且差异显著。 结论： 1.采用改良的胶原酶消化-密度梯度离心法分离的细胞建立的原代培养方法纯化度高，性质可靠。 2.小鼠肾脏近曲小管上皮细胞顶侧膜上存在一类低电导的内向整流K+通道，其分布广泛，可能参与钾离子转运、调节细胞体积及维持电势能的稳定。 3.CsA对近曲小管上皮细胞K+通道的影响主要在于对通道开放概率的抑制，可以推测CsA可能是通过影响顶侧膜的细胞旁通路使近曲小管对K+重吸收增加(也不排除由于细胞的直接毒性的影响)，这种作用可以用于解释尿钾排泄的降低及临床上高钾血症的出现。

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主要英文缩略词表

摘要

前言

第一部分 小鼠肾脏近曲小管上皮细胞培养及培养细胞的膜片钳记录方法的建立

第二部分 小鼠肾近曲小管上皮细胞顶侧膜钾通道的电生理学特性及环孢素A的影响

全文总结

致谢

参考文献

文献综述 肾小管钾离子通道及其功能调控

研究生期间发表的文章