EWS-FLI1介导白喉毒素表达对尤文肉瘤移植瘤杀伤作用研究

摘要

目的:白喉毒素A片段(DTA)对细胞有强烈的毒性,将DTA与不同的载体结合,对细胞可产生选择性杀伤作用.95﹪以上的尤文肉瘤家族(EFT)存在t(11;22)(q24;q12)染色体易位,形成EWS-FLI1融合基因,新的融合基因可识别、结合一段特异基因序列(ACCGGAAGT),并促进这段基因序列下游基因的高表达.该实验利用这一特点,观察EWS-FLII1介导的白喉毒素A链基因在裸鼠背部皮下移植瘤内的表达情况及其对肿瘤组织的杀伤作用.方法:1、用尤文肉瘤细胞系(SK-ES-1)于裸鼠背部皮下种植,建立实验用裸鼠尤文肉瘤皮下移植瘤模型.2、通过尾静脉注射脂质体与质粒混合物,将含有EWS-FLI1基因结合序列ACCGGAAGT及白喉毒素A链基因的真核表达载体pS2-DTA转染到裸鼠背部皮下的尤文肉瘤移植瘤内.3、观察肿瘤体积治疗前后变化,评价pS2-DTA对肿瘤的抑制作用;用组织病理切片光镜下观察肿瘤及心肌、肝组织细胞在治疗前后的形态学改变;免疫组织化学及RT-PCR检测白喉毒素A链基因表达;原位细胞凋亡检测,观察EWS-FLI1介导的白喉毒素A链基因表达后,肿瘤细胞的凋亡情况.结果:1、成功复制了尤文肉瘤裸鼠背部皮下移植瘤模型.2、治疗后RT-PCR检测证实,mRNA水平,pS2-DTA在肿瘤内可产生阳性表达,肝组织RT-PCR有弱阳性表达,其表达强度显著低于肿瘤组织(P<0.05) ,治疗组心肌组织RT-PCR结果呈阴性.3、心肌、肝组织免疫组织化学检测未见有阳性结果,肿瘤组织细胞胞浆内可见阳性棕黄色染色(SP法),靠近细胞核处染色略深.4、治疗组裸鼠经治疗,移植瘤体积显著小于对照组(P<0.01).5、病理切片光镜观察:理盐水组与脂质体组肿瘤病理切片见肿瘤细胞排列紧密,细胞核较大,居中,可见核分裂像,肿瘤细胞空泡形成少.而治疗组肿瘤组织中,肿瘤细胞排列疏松,可见有单个细胞与周围细胞分离现象,分离出的肿瘤细胞呈小圆形,胞浆含量少,染色深,细胞与细胞核同时明显缩小,核深染尤为显著.大多数受损伤肿瘤细胞表现为细胞肿胀,体积增大,肿胀的细胞内有较多空泡形成,细胞核缩小,着色深,细胞核偏向于细胞膜一侧.部分肿胀细胞的细胞核消失,形成空泡状结构.6、细胞原位凋亡检测(TUNEL法)发现,治疗组肿瘤细胞凋亡数明显多于自身的肝、心肌组织,肿瘤细胞凋亡指数显著高于肝、心肌组织(P<0.01).结论:1、EWS-FLI1介导的白喉毒A链基因经尾静脉注入可在裸鼠皮下移植尤文肉瘤内产生特异表达.2、EWS-FLI1介导的白喉毒A链基因对裸鼠皮下尤文肉瘤移植瘤有明显的抑制、杀伤作用,细胞凋亡是DTA所致肿瘤细胞死亡的重要形式.

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