HRE增强HSV-TK/GCV对乏氧环境Ewing肉瘤细胞杀伤作用的研究

摘要

目的 恶性实体肿瘤中心乏氧区肿瘤细胞对放疗、化疗的耐受性是导致治疗失败的重要原因之一.该研究拟构建一种由缺氧反应元件(hypoxia responsive element,HRE)调控的单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus-thymidine kinase,HSV-TK)基因的真核表达载体,观察HRE能否增强HSV-TK/丙氧鸟苷(gancyclovir,GCV)系统对乏氧环境中的人Ewing肉瘤细胞系(SK-ES-1细胞)的杀伤作用,为弥补放、化疗的不足探索有效的治疗方法.方法1 将化学法合成的HRE片断,插入到空载体(pIRES<,2>-EGFP)的双顺反子荧光蛋白报告基因的真核启动子的增强子部位,按插入片断上下游载体序列合成引物1、2,以PCR方法筛选含HRE片断的阳性克隆,测定鉴定,获得重组质粒pHRE;用引物3、4,以PCR法扩增TK基因片断,将其克隆到pIRES<,2>-EGFP及pHRE的双顺反子荧光蛋白报告基因上游的多克隆位点,用PCR筛选含单拷贝正向插入TK片段的阳性克隆,测序鉴定,获得重组质粒pTK及pHRE-TK.2 用阳离子脂质体将pHRE-TK、pHRE、pTK及pIRES<,2>-EGFP导入SK-ES-1细胞,分别在乏氧(O<,2>逍度为3﹪)和富氧(O<,2>浓度为21﹪)环境中培养16小时,荧光显微镜观察报告基因增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)表达变化,进行荧光光密度分析;再予以GCV处理上述质粒传染细胞5天后,用四唑盐法(MTT法)检测GCV对SK-ES-1细胞的杀伤效果.结论 1 成功地构建了含有HRE及HSV-TK基因片断的真核表达载体;2 HRE显著增强HSV-TK/GCV对乏氧环境中Ewing肉瘤细胞的杀伤效率.

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文献综述一1缺氧反应基因的表达调控与肿瘤

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文献综述二蛋白质组学研究的内容、方法及意义

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