一个新的HBcAg之H-2 K限制性表位的鉴定及其功能特性研究

摘要

CD8+T淋巴细胞是机体免疫系统的主要组成部分，在针对病毒、细胞内细菌和真菌等病原性微生物以及恶性肿瘤等的免疫监视、免疫防御以及免疫治疗等过程中发挥关键性的作用。 慢性HBV感染是一全球性的重大健康问题。HBV感染的慢性化主要是因为机体对HBV的免疫应答，特别是细胞免疫应答，不能清除病原，导致感染的持续存在。已经有文献表明CTL的细胞毒性和产生细胞因子是两个独立调节的过程，并非总是伴随发生，因此在进行CTL表位鉴定和评价时很有必要分析肽诱导的效应细胞分泌细胞因子的能力。 HBcAg是HBV的一种结构蛋白，具有强的免疫原性。我们想知道文献报道的该肽中的CTL表位HBcAg(87-95)特异性CTL除了具有细胞毒性外能否分泌细胞因子以及该肽中是否存在其它的H-2Kd限制性CTL表位，采用常规的CTL表位鉴定程序进行扫描和鉴定。我们同时采用BIMAS和SYFSYFPEITHI程序扫描该抗原的全部氨基酸序列，选择评分最高的4种9-氨基酸肽或10-氨基酸肽为候选表位。在合成、纯化和鉴定这些肽后用稳定表达H-2Kd的RMA-S/Kd转染细胞系分析各肽与Kd结合的亲和力，并计算在不同的肽浓度下的荧光系数(FI)。构建了含有HBcAg(ayw亚型)编码序列的真核表达质粒pcHBc3.1+，进行酶切电泳、测序和细胞转染鉴定并建立稳定表达该抗原的转染细胞系P815C。采取肌肉注射的方式用质粒免疫Balb/C小鼠后分离脾细胞，制备脾细胞悬液，在体外用各种候选表位肽进行诱导培养。5天后收集脾细胞和细胞培养上清分别通过ELISPOT法和ELISA法分析各肽诱导小鼠脾细胞分泌IFNγ的能力，收集脾细胞分析其细胞毒性，先后以转染细胞系P815C和肽脉冲的P815细胞为靶细胞。结果表明，HBcAg(131-139)和用作阳性对照的HBcAg(87-95)一样，都可以与H-2Kd结合，各自的FI值均随肽浓度的增加而增加，前者的亲和力略低于后者。两种肽都可以诱导质粒免疫后的小鼠脾细胞分泌IFNγ，包括用脾细胞进行的ELISPOT分析和用细胞培养上清进行的ELISA分析。但是，与阳性对照不同，HBcAg(131-139)诱导的小鼠脾细胞没有细胞毒性，不能杀伤靶细胞，包括P815C细胞和脉冲肽的P815细胞，提示这是一类特殊的表位特异性CTL。其余三种候选肽与H-2Kd结合亲和力较低或不能结合，也不能诱导小鼠脾细胞产生IFNγ或杀伤靶细胞。进一步分析表明，经该肽诱导的小鼠脾细胞大多为CD8+，诱导后的CD8+细胞频率明显高于诱导前；该肽诱导的小鼠脾细胞分泌IFNγ是H-2Kd限制性和CD8依赖性的，因为在ELISPOT分析过程中加入抗H-2Kd单克隆抗体和抗CD8单克隆抗体明显抑制IFNγ的分泌。以同品系的HBV转基因小鼠模拟慢性无症状HBV携带者状态，观察这些表位特异性CTL在体内的效应。体外诱导扩增表位肽特异性CTL后静脉输入HBV转基因小鼠，并观察细胞输注后小鼠血清丙氨酸转氨酶活性、血清HBVDNA载量以及小鼠肝组织学变化和肝内HBcAg的表达变化。发现HBcAg(131-139)和HBcAg(87-95)一样，均可以明显降低小鼠血清HBVDNA载量和肝中HBcAg的表达。但不一样的是，HBcAg(131-139)诱导的小鼠脾细胞没有引起明显的血清转氨酶升高和肝组织坏死，而HBcAg(87-95)诱导的脾细胞可以。这些结果表明，HBcAg(131-139)是一种特殊的HBV来源的小鼠H-2Kd限制的CD8+T细胞表位，其特异性的CD8+T细胞在抗原性刺激的条件下，能够分泌IFNγ但是没有细胞毒性。该结论进一步证实了以前认为的表位特异性CTL分泌细胞因子和发挥细胞毒性是两个独立调节的过程，可以分离的观点。更为重要的是我们的结果初步证实了这些效应的差异调节至少在一定程度上是由其表位特异性决定的。 我们选择目前已经鉴定出来的5种HBV来源的小鼠H-2d限制性的CTL表位，包括我们新发现的特殊的表位HBcAg(131-139)，在体外和体内分析了各表位特异性CTL的效应特点，包括分泌细胞因子IFNγ和细胞毒性。构建并鉴定了含有HBsAg(ayw亚型)编码序列的真核表达质粒pcHBs3.1+。先用质粒pcHBc3.1+和pcHBs3.1+肌肉注射免疫Balb/C小鼠，分离脾细胞，在体外用相应表位肽诱导培养。5天后用上述方法分析IFNγ的分泌和细胞毒性，用肽脉冲的P815细胞为靶细胞。然后将体外肽诱导扩增的CTL静脉输注入HBV转基因小鼠中，分析小鼠血清转氨酶和HBVDNA载量的变化，以分别反映CTL在体内分泌IFNγ和杀伤靶细胞的能力。结果表明，各肽诱导的CTL的两个方面的效应能力不是完全平行的，有的倾向于更多地分泌IFNγ，有的更多地发挥细胞毒性。而单单比较某一方面地效应，不同的CTL也不相同，有高有低。除了HBcAg(131-139)特异性CTL能够分泌IFNγ而几乎没有细胞毒性这种典型情况外，HBcAg(87-95)特异性CTL的细胞毒性和分泌IFNγ的能力都是最强的，H-2Ld限制性表位HBsAg(28-39)特异性CTL分泌IFNγ的能力仅次于HBcAg(87-95)特异性CTL，但是其细胞毒性在5种细胞中仅仅高于几乎没有细胞毒性的HBcAg(131-139)特异性的CTL。HBV转基因小鼠体内的实验结果与体外的实验结果一致，体外分泌细胞因子能力强的在体内抑制HBV复制的能力也较强，体外细胞毒性强的在体内导致血清转氨酶活性升高更多。再次证实了以前建立的HBV转基因小鼠体内HBV复制抑制主要由CTL分泌的IFNγ等细胞因子完成，而肝细胞损伤、血清转氨酶的升高主要由CTL的细胞毒性完成的观点，也初步证实了表位决定效应的观点。 总之，我们发现并鉴定了一个特殊的来自HBcAg的小鼠H-2Kd限制性的CD8+T细胞表位，该表位特异性的CD8+T细胞遭遇抗原性刺激时分泌IFNγ而几乎不能杀伤靶细胞。这是第一个被描述的完全基于非细胞溶破机制的CTL表位，表明CTL确实存在异质性，其异质性不仅仅表现在细胞表型、组织学分布和趋化因子受体等分子的表达方面，还可以表现在在效应上：CTL除了可以穿孔素/颗粒酶、Fas-Fas等细胞毒方式杀伤靶细胞外，还可以非细胞溶破的方式抑制乃至清除病毒。提示CTL表位至少可以基于其特异性CTL的功能分为两大类：细胞溶破性表位和非溶破性的表位。我们比较分析了5种来自HBV的小鼠H-2d限制性CTL表位在体外分泌IFNγ、杀伤靶细胞的效能和在HBV转基因小鼠体内损伤肝细胞、抑制HBV复制的效能，不同表位特异性的CTL的效率不同，尽管有的是来自同一个抗原。该结果初步表明CTL的效应机制和效应能力至少在一定程度上是由其表位特异性决定的，即表位决定效应。因此我们在了解各表位特异性CTL和感染或肿瘤等疾病的免疫发病机理的基础上，可以选择恰当的表位或表位组合构建疫苗，诱导恰当的CTL应答，既可以治疗疾病，又避免宿主机体的损伤。

目录

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英文缩写一览表

第一部分HBcAg之H-2 Kd限制性表位的发现及其功能特性

前 言

第一节HBcAg的H-2 Kd限制性CD8+T细胞表位的预测

第二节候选表位肽的合成、纯化与鉴定

第三节候选表位肽与H-2 Kd结合的亲和力分析

第四节HBcAg真核表达质粒和转染细胞P815C的建立及鉴定

第五节CD8+T细胞表位的鉴定

第六节HBcAg(131-139)的免疫学特征及其特异性CD8+T细胞在HBV转基因小鼠中的效应

材料和方法

结果

结果1HBcAg（131-139）刺激的脾细胞CD8的表达

结果2HBcAg（131-139）诱导脾细胞分泌IFNr的H-2Kd和CD8依赖性

结果3HBV转基因小鼠血清ALT活性分析

结果4HBV转基因小鼠血清HBVDNA浓度分析

结果5组织学变化

结果6肝内HBcAg的表达

讨 论

第二部分针对HBV不同表位特异性的CD8+T细胞的功能比较研究

前 言

第一节源于HBV的H-2d限制性表位肽的合成、纯化和鉴定

第二节HBsAg真核表达质粒和转染细胞P815S的建立及鉴定

第三节各表位特异性CTL体外分泌IFN γ和细胞毒性效应分析

第四节各表位特异性CTL在HBV转基因小鼠体内的肝损伤和抑制HBV复制效应分析

讨论

参考文献

全文总结

致 谢

文献综述一慢性乙型肝炎免疫治疗研究进展

文献综述二基于流式细胞术的细胞毒性T淋巴细胞分析

在读期间发表和拟发表论文