视神经NgR mRNA的表达及其siRNA表达质粒载体的构建

摘要

视神经损伤是临床常见的眼外伤，迄今仍缺乏有效的治疗手段。目前的研究证实：视神经再生失败的原因除了与其自身再生潜力低下，损伤后营养因子的缺乏，胶质瘢痕的形成等有关外，其所处的微环境中存在着神经生长抑制因子也是一个重要因素。2002年研究发现：少突胶质细胞及其所形成的髓鞘中存在着的抑制蛋白——Nogo-66、MAG、OMgp，均通过NgR发挥作用，针对NgR的单克隆抗体可有效地促进中枢神经元轴突再生。NgR在中枢神经系统中分布广泛，灰质中含量较高，大脑皮层、海马、背侧丘脑、小脑颗粒细胞等都有分布，但是，视神经作为一种特殊的中枢神经，其中是否存在NgR的表达尚未见报道，同时，能否利用RNA干扰技术来抑制NgR基因表达，继而阻断几种抑制因子(Nogo-66、MAG、OMgp)的作用，进而促进视神经再生修复也未见报道。 本实验的目的：检测NgRmRNA在视神经的表达情况，观察视神经损伤后NgRmRNA的表达变化，构建NgRmRNA特异的siRNA表达质粒，为进一步通过RNA干扰途径来抑制NgR基因表达，促进视神经再生研究奠定基础。 方法：实验分为3个部分：(一).使用地高辛标记的寡核苷酸探针通过原位杂交方法检测视神经中NgRmRNA的表达情况；(二).采用荧光定量PCR方法检测视神经损伤后NgRmRNA的表达变化；(三).构建NgRmRNA的siRNA表达质粒。 结果：1.原位杂交证实视神经NgRmRNA表达阳性，对照实验呈阴性反应；2.荧光定量PCR显示视神经损伤后NgRmRNA表达无显著性变化(P＞0.05)；3.成功的构建了两个NgR特异的RNA干扰表达质粒，为下一步实验奠定了基础。 结论：视神经存在NgRmRNA表达，提示NgR介导的抑制途径可能是视神经损伤后难以再生的一个原因；视神经钳夹伤后NgRmRNA表达无显著性变化，而我们的前期实验显示视神经钳夹伤后Nogo-AmRNA的表达增高，配体和受体表达的不一致性，提示了Nogo-A除了抑制再生外，可能还有其它尚未阐明的功能，较之阻断Nogo-A而言，阻断NgR的作用可能是一条促进视神经再生更直接和有效的途径；NgRsiRNA表达质粒的成功构建，为后续实验通过RNA干扰技术研究NgR基因对视神经再生的作用奠定了基础。

目录

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摘要

前言

实验一原位杂交检测成年大鼠视神经NgR mRNA的表达

实验二视神经钳夹伤后NgR mRNA表达的变化

实验三NgR特异的RNA干扰质粒载体的构建

讨论

结论

致谢

图片

参考文献

文献综述髓磷脂相关性轴突生长抑制因子与中枢神经再生

硕士期间撰写和发表的论文

附录1：pSUPER-EGFP1质粒载体结构示意图

附录2：NgR siRNA阳性序列1设计报告图

附录3：NgR siRNA阳性序列2设计报告图