表皮干细胞向角膜上皮细胞转分化的实验研究

摘要

表皮是皮肤重要的组成部分，由内向外分为基底层、棘层、颗粒层、透明层和角质层。早期使用3H-TdR标记的方法观察表皮中标志物的分布，发现绝大多数标志保留细胞(labelretainingcell，LRC)位于表皮的基底层，约占基底细胞的10％，有慢周期性，同时具有自我更新并不断增殖和分化的能力，在皮肤的再生修复过程中起着重要的作用，故命名此类细胞为表皮干细胞(ESCs)。目前，表皮干细胞的组织定位已得到广泛认同，体外培养技术也取得较大的发展，为其生物学性状的研究及在组织工程方面的应用奠定了基础。本实验中采用Ⅳ型胶原对细胞的差速黏附以及低钙无血清的培养体系，获得了纯度较高的具有干细胞性质的细胞，并在培养状态下观察了该类干细胞的生长特性及表达特性，通过检测细胞表面标志物的表达进一步证实了所得到的细胞是表皮干细胞。 角膜是眼球屈光的重要组成部分，容易遭受外界因素的侵袭而被损伤。角膜移植是目前治疗角膜盲的唯一有效方法。从角膜库的建立、人工角膜到组织工程化角膜的发展，为角膜缺损的修复开辟了崭新的治疗前景。尽管大量研究用角膜缘干细胞作为种子细胞，但细胞来源的有限性使其应用和推广受到限制。近年来很多实验证实了成体干细胞具有横向分化能力，表皮干细胞不仅能分化为表皮，在一定的条件下还能分化成不同胚层来源的细胞，分化的方向受该干细胞生长微环境的调控。角膜基质对角膜上皮的分化具有重要的作用，基质细胞分泌的多种因子EGF、NGF、IGF、TGF等形成的网络调控能促进细胞的特定分化。本实验中应用角膜基质为诱导环境，应用transwell培养体系，将角膜基质细胞与表皮干细胞进行共培养，经过诱导分化后，用角膜上皮特异的标志物K12对表皮干细胞进行检测。本实验结果证明表皮干细胞在体外诱导培养下具有向角膜上皮细胞横向分化的能力。主要研究结果如下： 1.表皮干细胞的组织定位与生物学性质 体外成功地培养出表皮干细胞，为下一步实验打下基础。KSFM培养基适宜表皮干细胞的生长，其无血清低钙的环境能较好的维持表皮干细胞处于低分化状态，并保持表皮干细胞较强的增殖能力；利用表皮干细胞对Ⅳ型胶原快速黏附的性质对细胞进行筛选，该干细胞在Ⅳ型胶原上生长良好。培养的细胞形态均一，呈铺路石状，细胞小而圆，核浆比例大，表现出原始细胞形态的特征。细胞在培养7～8天细胞数量达峰值，与表皮细胞比较，培养的表皮干细胞具有较高的克隆形成率。免疫细胞化学染色显示体外培养的表皮干细胞强表达K19和β1-integrin，而K10阴性，组织切片的染色也显示表皮基底层的细胞表达K19和β1-integrin，K10则在表达在基底上层。同时用免疫荧光双标检测细胞α6-integrin和CD71的表达，细胞强表达α6-integrin，而CD71表达较弱或阴性。以上表明本实验方法能培养出纯度较高的表皮干细胞。 2.ESCs定向诱导分化中微环境的建立 Dispase消化法能获得组织形态上完整、具有良好生存活力的角膜缘基质片，并且在体外培养中能保持一定的活性。同时体外培养证实原代和传第一代的角膜缘基质细胞具有良好的增殖活力，可以用于诱导分化微环境的建立。无血清的KSFM培养基也能维持角膜缘基质细胞良好的生长，与角膜组织中的角膜基质细胞相近。 3.ESCs向角膜上皮细胞的定向诱导分化 采用与角膜缘基质细胞非接触共培养，在细胞饲养层上接触培养以及在角膜缘基质片上接触培养三种方法对ESCs进行诱导培养。经过两周的培养，第一种方法诱导培养的ESCs逐渐分化、分层，其中部分细胞形态上相对偏小，胞核明显，免疫组化检测这部分细胞表达角膜上皮细胞特异性标志K12，说明表皮干细胞具有向角膜上皮细胞分化的潜能。 本实验成功的培养出ESCs，并首次成功的将表皮干细胞在体外诱导，向角膜上皮细胞分化。为角膜组织工程中种子细胞的来源开辟了一个新的途径，也为成体干细胞转分化能力的研究提供了一个科学依据。

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摘要

前言

第一部分表皮干细胞的组织定位与生物学性质

第二部分ESCs定向诱导分化中微环境的建立

第三部分ESCs向角膜上皮细胞的定向诱导分化

致谢

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参考文献

文献综述成体干细胞可塑性的研究进展

研究生在读期间发表的文章