屋尘螨过敏原转染树突状细胞诱导哮喘小鼠免疫耐受的研究

摘要

目的：“Th1/Th2偏移”假说是哮喘发病的主要免疫学机制，但近年的研究发现该学说不能完全解释哮喘的免疫学机制异常，提出了哮喘是一种对过敏原免疫耐受缺陷的疾患，其中树突状细胞(DCs)可能是关键的调节因素之一。本实验拟构建尘螨主要变应原基因重组的DCs，研究基因屋尘螨重组DCs诱导哮喘小鼠对致敏抗原的免疫耐受作用和机制。 研究内容： 1.分离小鼠骨髓后体外培养扩增DCs。 2.将屋尘螨主要过敏原Derp1、Derp2真核表达质粒转染DCs，构建过敏原重组DCs，观察过敏原基因转染对DCs表面分子和炎性介质分泌的影响； 3.建立屋尘螨提取液致敏/激发小鼠的肺部变应性炎性模型。 4.观察屋尘螨过敏原重组DCs对小鼠脾脏淋巴细胞中调节性T细胞及肺泡灌洗液中细胞因子、肺组织病理变化的影响。 5.观察清除调节性T细胞对屋尘螨重组DCs作用的影响 方法： 1.分离小鼠骨髓细胞，在含GM-CSF的完全培养基进行培养。以流式细胞仪鉴定培养细胞表面分子CD8α、CD11c、MHCⅡ分子。 2.将携带有屋尘螨主要过敏原Derp1、Derp2的pDs-Derp1、pCIneo-Derp2质粒转化入大肠杆菌DH5α后大量扩增抽提质粒。以Lipofectamine2000分别将此二质粒转染DCs后，以流式细胞仪检测其细胞表面分子CD40、CD80、CD86、MHCⅡ的变化。采用ELISA方法检测转染后DCs分泌IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ和TGF-β1的变化，采用RT-PCR方法检测Derp1、Derp2在DCs内的表达。 3.用尘螨提取液经腹腔和皮下注射途径致敏C57BL/6小鼠，14天后滴鼻激发，建立尘螨致敏小鼠肺部变应性炎症模型。 4.分离哮喘小鼠和正常小鼠脾脏CD4+T细胞分别加入屋尘螨重组DCs和非重组DCs进行共培养后，检测上清液中IL-4、IL-10、IFN-γ含量的变化，观察屋尘螨重组DCs和非重组DCs对CD4+T细胞中CD4+CD25+T细胞、CD25+IL-10+T细胞含量的影响。 5.复制小鼠哮喘模型后，将Derp1、Derp2真核表达质粒及Derp1、Derp2重组DCs免疫C57BL/6小鼠，再用屋尘螨提取液进行激发，病理切片观察小鼠肺部炎症变化并进行计分、计算BALF细胞总数并进行分类计数；ELISA检测BALFIL-4、IL-5、IL-10和IFNγ以及血清总IgE水平。分离脾脏淋巴细胞，流式细胞仪方法检测CD4+CD25+T、CD25+IL-10+T细胞的变化。 6.复制哮喘小鼠模型，予以Derp1、Derp2重组DCs干预后，使用anti-CD25mAb清除小鼠CD25+T细胞，用尘螨提取液激发，病理切片观察小鼠肺部炎症变化，计算BALF细胞总数并进行分类计数，检测BALF中IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12和IFNγ以及血清总IgE含量，分离脾脏淋巴细胞，流式细胞仪方法检测CD4+CD25+T、CD25+IL-10+T细胞的变化。 结果： 1.培养的DCs以未成熟DC为主。 2.Derp1和Derp2真核表达质粒转染DCs后可检测到编码目的变应原的基因转录。转染后DCs表面分子CD86表达有所降低，其余分子无显著变化，所分泌的细胞因子IL-10、IL-12、TGF-β明显增加，而IFN-γ、IL-4分泌无明显变化。 3.尘螨提取液致敏/激发C57BL/6小鼠肺部呈现显著变应性炎症，肺血管及肺组织局部嗜酸细胞浸润明显，BALF中细胞总数和嗜酸性粒细胞计数、IL-4、IL-5水平均显著升高，IFN-γ降低，血清总IgE水平显著升高。 4.在受到过敏原刺激时，哮喘小鼠CD4+T细胞较正常组小鼠CD4+T细胞分泌IL-4显著增加，分泌IL-2、IL-10以及IFNγ显著降低；哮喘小鼠脾脏CD4+T细胞经屋尘螨重组DCs处理后，培养液上清中IL-4含量显著下降，IL-10、IL-2显著增加，IFN-γ虽然有增加的趋势，但无明显统计学差异。正常CD4+T细胞在分别加入未成熟DCs和屋尘螨重组DCs后IL-10分泌增加，IL-2、IL-4、IFN-γ则无显著差异。经屋尘螨重组DCs及未成熟DCs处理后，哮喘组和正常组CD4+T中CD25+T比例明显增高，其中以屋尘螨重组DCs诱导的哮喘CD4+T细胞中CD25+T增加最为显著。CD25-IL-10流式细胞检测表明，在屋尘螨重组DCs诱导的CD4+T细胞中，IL-10+CD25+T细胞占CD25+T的50％以上。 5.用尘螨质粒DNA疫苗、未成熟DCs和屋尘螨重组DCs免疫的小鼠其肺部炎症病理变化减轻，BALF中细胞总数和嗜酸性粒细胞计数、IL-4、IL-5以及血清总IgE水平均较空白质粒对照致敏鼠显著降低，而IL-10、TGF-β、IL-2显著升高，其中基因重组DCs更为显著，与正常组相比无明显差异。经屋尘螨重组DCs处理后，哮喘小鼠脾淋巴细胞中CD4+CD25+T细胞比例显著增加，其中CD25+IL-10+细胞增加更为明显，提示SIT治疗诱导了Tregs特别是iTregs细胞增加。 6.在使用anti-CD25单抗清除CD25+T细胞后，屋尘螨过敏原重组DCs未能引起小鼠肺部变应性炎症的逆转，BALF中IL-4、IL-5分泌血清中总IgE含量显著增加，IL-2、IL-10、IL-12及IFN-γ分泌受到抑制；同时脾淋巴细胞中CD4+CD25+和CD25+IL-10+细胞显著下降。 结论： 1.屋尘螨主要过敏原基因转染对DCs表面分子的表达无显著的影响，仍以未成熟型为主要表现。但屋尘螨重组DCs分泌调节性细胞因子IL-10、TGF-β以及Th1反应的诱导和增强因子IL-12增加。 2.在体外屋尘螨过敏原基因重组DCs与正常和哮喘小鼠CD4+T细胞共培养能有效诱导CD4+CD25+Tregs和CD25+IL-10+Tregs的产生，诱导调节性细胞因子IL-10增加，抑制Th2细胞因子，增强Th1细胞因子的分泌，且作用显著强于非重组未成熟DCs。 3.使用尘螨提取液致敏/激发可成功建立小鼠肺部变应性炎症模型。这对于探讨变应原致敏哮喘的特异性免疫治疗是一个有用的研究模型。 4.所构建的屋尘螨主要变应原重组DCs疫苗，能显著抑制哮喘小鼠肺部变应性炎症、Th2反应，使血清IgE降低，Th1反应和Tregs反应增强，且作用显著强于非重组DCs和质粒DNA疫苗。 5.在去除CD25+T细胞后，屋尘螨重组DCs未能再抑制哮喘小鼠肺部变应性炎症和Th2反应，血清IgE水平较高，但Th1反应也增强，说明Tregs对Th1反应也有抑制作用，清除Tregs后Th1反应也增强，但单独Th1增强不足以逆转Th2反应和抑制哮喘小鼠肺部变应性炎症。意义： 1.本研究发现过敏原基因重组DCs可以诱导哮喘动物对过敏原的“免疫耐受”，提示DCs不仅在活化T细胞，而且可以在诱导T细胞的免疫耐受中起关键的作用。这些发现也从理论上更新了过去对哮喘免疫学机制异常的认识。 2.重组DCs载体DNA疫苗治疗的方法为临床哮喘的治疗提供了一种全新的思路。动物实验的结果是令人鼓舞的，但要过渡到临床的应用仍需要解决大量的技术问题以及有效性和安全性的验证。

目录

第三军医大学研究生学位论文独创性声明及版权使用授权书

英文缩写一览表

前言

第一部分屋尘螨重组DCs的构建以及基因转染对DCs表面分子和细胞因子分泌的影响

第二部分屋尘螨主要过敏原重组DC对哮喘小鼠肺部变应性炎症及CD5+CD25+调节性T细胞的影响

全文结论

参考文献

致谢

照片

文献综述一 调节性T细胞与过敏原特异性免疫治疗

文献综述二 屋尘螨主要过敏原Der p1研究进展