AQP4在颅脑爆炸伤后脑水肿发生机制中的作用研究

摘要

颅脑爆炸伤的研究是目前国内外军事医学研究的重点内容，而脑水肿是影响其伤情发展和预后的重要因素，脑水肿的治疗是目前临床难题之一。近年来AQPs的发现给脑水肿的治疗带来了新的希望，因为它仅对水选择性通过，而尿素、甘油和其它中性小分子溶质不能通过。AQP4是脑内含量最多的水通道蛋白，主要在血-脑和脑脊液-脑的交界面上的星形胶质细胞上表达，对维持脑内水平衡起着非常重要的作用。国内外许多研究证实脑外伤后AQP4在局部表达增高和脑水肿密切相关。AQP4基因剔除小鼠创伤性和水中毒性脑水肿的程度明显减轻，对AQP4表达进行调控有可能为创伤性脑水肿的治疗提供新途径。但AQP4在爆炸伤后脑水肿中的表达变化规律缺乏相关文献报道，并且由于AQP4为汞非敏感性水通道蛋白，目前亦无对其表达和功能进行有效抑制的药物。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是近年来发现的一种研究基因表达调控与功能的新技术。本课题拟通过建立大鼠脑爆炸伤动物模型，研究AQP4在爆炸伤后脑水肿中的作用和机制，并在体外构建携带有特异抑制AQP4基因的短发夹环质粒载体，运用脂质体法转染体外培养的星形胶质细胞，在体通过右侧脑室给药途径，观察AQP4基因沉默效果及其对爆炸伤后脑水肿的影响。 本课题的研究主要包括以下四个部分，所取得的主要结果及结论如下： 第一部分大鼠颅脑爆炸伤模型建立及病理学变化观察 1.本研究分别应用80mg、150mgTNT当量电雷管在垂直爆炸距离为5cm的条件下对右侧颞顶部开直径1cm骨窗的大鼠进行定点爆炸致伤，结果发现150mgTNT当量组大鼠全部于2d内死亡，80mgTNT当量组大鼠动物存活时间超过7天，符合观察脑水肿发展、转归的需要。 2.在此基础上，我们观察了伤后不同时间脑含水量以及光、电镜病理变化，结果发现损伤区呈进展性脑水肿，并于伤后2d达高峰，在伤后4～12小时主要以损伤中心血管扩张充血和细胞间质水肿为主要表现，部分血管破裂出血，电镜观察以血管内皮细胞受损改变为主；伤后1～2d出现深层白质神经元和胶质细胞的水肿，但此部位血管内皮细胞受破坏不明显，伤后5～7d，脑水肿表现逐渐减轻。 第二部分大鼠颅脑爆炸伤后AQP4表达变化研究 1.在前述模型的基础上我们检测了损伤区Evansblue渗出变化以观察爆炸伤后血-脑屏障改变，结果发现在爆炸伤后4h和12h，Evansblue渗出主要局限于损伤中心，随时间延长，尽管脑水肿程度加重，但EB渗出范围无明显扩大。 2.观察了AQP4mRNA和蛋白表达变化规律，并分析了其与脑含水量的相关性，结果发现损伤区AQP4mRNA和蛋白表达水平明显升高，开始局限于损伤中心，随时间延长，其表达范围也逐渐扩大，并于伤后2d达高峰，伤后5～7d，表达水平逐渐下降，但仍高于正常水平。AQP4mRNA和蛋白表达水平与损伤区脑含水量呈明显正相关。 以上结果表明爆炸伤早期以血管源性脑水肿为主要表现，后期继发性细胞毒性脑水肿可能为爆炸伤后脑水肿的主要原因。AQP4表达增加参与了爆炸伤后脑水肿的形成过程，抑制AQP4的表达可能有对于减轻爆炸伤后脑水肿有所帮助。 第三部分体外培养的星形胶质细胞AQP4RNAi研究 1.构建携带有特异抑制AQP4的短发夹环质粒载体AQP4RNAipGenesil-2A，氯化钙法转染大肠杆菌dH5α，扩增后提取超纯质粒，基因测序确认其携带有正确的目标序列。 2.原代培养新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞，经GFAP免疫组织化学方法鉴定纯度在95％以上。将AQP4RNAipGenesil-2A质粒载体用脂质体法转染第3代星形胶质细胞，分别用免疫组织化学和RT-PCR方法鉴定AQP4蛋白的表达，结果发现，与正常对照组相比转染后第7天AQP4mRNA和蛋白表达水平分别减少了80.12±1.01％和80.2±2.54％，细胞数量减少约60％，扁平和多角形星形胶质细胞突起变少，呈类纤维形改变。水通透实验证实经AQP4RNAi的星形胶质细胞体积增大的速度慢于正常星形胶质细胞。 以上结果提示AQP4在星形胶质细胞快速水转运中起重要作用；构建的AQP4RNAipGenesil-2A质粒载体可对星形胶质细胞AQP4基因起抑制作用，可作为下一步研究的工具；体外培养的星形胶质细胞需要功能量的AQP4来维持其形态、生长和增殖的需要。 第四部分AQP4RNAi对颅脑爆炸伤后脑水肿的影响 实验一脑内AQP4RNAi在体实验研究 1.本实验通过向右侧脑室注入脂质体包裹的AQP4短发夹环质粒载体，于术后不同时间运用原位杂交和免疫荧光组织化学方法观察大脑半球、小脑和脑干上AQP4蛋白及mRNA表达改变，以验证其对脑内AQP4的抑制效果。结果发现于术后第7天全脑AQP4mRNA和蛋白分别减少了63.65±2.35％和62.75±3.6％。 2.脑内AQP4RNAi后大鼠的精神、饮食、行为和肢体活动未发现明确异常。光、电镜病理检查亦未见双侧大脑半球、脑干和小脑的神经元与胶质胶质细胞形态发生明显改变。 以上结果表明短发夹环AQP4RNAi质粒载体能有效减少脑内AQP4的表达，对中枢神经的功能无明显影响，符合下一步研究的需要。 实验二AQP4RNAi对爆炸伤后脑水肿的影响研究 1.在前述实验的基础上，我们分别在伤前7天和伤后1小时采用右侧脑室给药的方法对大鼠进行AQP4RNAi，通过与爆炸伤组损伤区AQP4mRNA和蛋白表达水平以及脑含水量进行比较，在爆炸伤后4h，爆炸伤组、伤前RNAi组和伤后RNAi组相比，损伤区脑含水量差异不显著，p＞0.05；12h～7d，同一时间点爆炸伤前、后进行AQP4RNAi组大鼠脑含水量均明显低于只行爆炸致伤而未进行AQP4RNAi组大鼠，P＜0.01。伤前AQP4RNAi组损伤区脑含水量在伤后4h迅速增加，12h即达高峰，伤后2d开始下降，到第7d已恢复到正常水平；伤后AQP4RNAi组损伤区脑含水量亦在4h迅速增加，但于伤后1d达高峰，2d后开始下降，到第7d恢复到正常水平。伤前和伤后AQP4RNAi组最高脑含水量明显低于爆炸伤组最高脑含水量，p＜0.01。伤前RNAi组最高脑含水量低于伤后RNAi组最高脑含水量，p＜0.01。 2.爆炸伤前和爆炸伤后进行AQP4RNAi组大鼠星形胶质细胞和神经元水肿的范围和程度均低于爆炸伤组； 以上结果提示AQP4可能对爆炸伤早期(4h内)脑水肿的形成过程影响较小，而后期的脑水肿加重过程可能和AQP4表达增高有关。采用AQP4RNAi的方法可明显减轻爆炸伤后脑水肿。

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摘要

前言

第一部分大鼠颅脑爆炸伤模型建立及病理学变化观察

第二部分大鼠颅脑爆炸伤后AQP4表达变化研究

第三部分体外培养的星形胶质细胞AQP4 RNAi研究

第四部分AQP4RNAi对颅脑爆炸伤后脑水肿的影响

全文总结

致谢

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文献综述脑水肿和水通道蛋白的研究进展

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