基因工程化神经干细胞结合组织工程材料治疗周围神经损伤的实验研究

摘要

神经损伤的再生修复一直是神经科学研究的难点和焦点。目前的研究表明，周围神经损伤后虽有一定的自我再生能力，但良好的再生修复更需要神经营养因子(NTFs)、基质和神经细胞这三方面因素的协同作用来实现。 本实验运用细胞培养技术、基因转染技术、流式细胞计数、免疫组织(细胞)化学技术、HRP逆行示踪、坐骨神经功能指数，膜片钳电生理技术等方法，分离、培养大鼠大脑皮层NSCs，观察NSCs与壳聚糖、雪旺细胞(Schwann'scells，SCs)共培养条件下生长、分化的情况。并将GDNF基因在体外转染到NSCs中，筛选、扩增后移植到经过壳聚糖管套接的大鼠坐骨神经离断模型中，以满足神经再生修复的三大因素，观察评价治疗效果，为损伤神经的治疗探索新的可行性。主要结果如下： 1.本实验分离、培养胚胎大鼠大脑皮层NSCs。细胞呈球状悬浮生长，细胞克隆传代至8～9代仍具有干细胞特性。细胞克隆经NSCs特异性标记物Nestin抗体免疫荧光标记后，呈强阳性。经10％FBS诱导后，在干细胞团周围可见大量的、不同形态增殖的新生细胞，呈放射状向外迁移、增殖。分化的细胞分别呈Anti-GFAP及Anti-MAP2反应阳性。 2.将NSCs种植在壳聚糖膜上的实验发现，部分NSCs细胞球以底部粘于壳聚糖膜上，但仍保持球形生长。在相同生长时间点上，壳聚糖膜上的神经球数目和神经球的直径与正常对照组无显著差别。说明壳聚糖膜与NSCs有较好的组织相容性，NSCs在壳聚糖膜上不会影响其生长，NSCs仍然保持原有的特性。 3.生长于壳聚糖膜上的NSCs，经FBS诱导后同样可分化为神经元和胶质细胞。与对照组比较，生长于壳聚糖膜上的NSCs更容易分化，表现为分化时间更早，分化出的细胞更多。通过Anti-GFAP、Anti-MAP2免疫组化染色后的图像分析显示，壳聚糖膜上生长的NSCs分化出的神经胶质细胞以及神经元均明显多于对照组。说明壳聚糖更加适宜NSCs的分化。 4.将NSCs与SCs共同培养后观察到NSCs的分化现象。与自然诱导分化的对照组比较，共培养组分化细胞数目明显多于对照组，其中Anti-MAP2染色阳性神经元样细胞的百分率明显高于对照组。表明SCs能促进NSCs的存活和分化，更能促进其向神经元样细胞分化。 5.经流式细胞仪检测分析，结果显示在壳聚糖膜上诱导分化组以及与SCs共培养组中，Anti-MAP2阳性的神经元百分比均较自然分化组显著增高。同时，与SCs共培养的NSCs分化的Anti-MAP2阳性细胞百分比也较壳聚糖膜上诱导分化组显著增高。 6.本实验利用含有大鼠GDNF的cDNA序列基因的pGDNF3a质粒，经质粒的转化、扩增、抽提和纯化，并酶切鉴定后与逆转录病毒载体pLXSN重组，构建了pLXSN-GDNF重组体，分别以pGDNF3a、pLXSN-GDNF及pLXSN质粒DNA为模板，用GDNF特异性引物进行PCR，扩增出长度为0.66kb的GDNF基因片段，符合理论大小。 7.用pLXSN-GDNF逆转录病毒重组体感染培养生长旺盛的NSCs，G418筛选后，这些基因工程化细胞经10代左右的培养后，仍能形成悬浮生长、具有较强活性的细胞克隆。经诱导分化，NSCs克隆仍可分化为神经元和胶质细胞。且这些分化细胞也有较强GDNF基因的表达。 8.基因工程化神经干细胞经Anti-GDNF免疫荧光鉴定结果显示，有60～80％的NSCs感染了pLXSN-GDNF。诱导分化后的细胞也呈Anti-GDNF免疫阳性反应。提取细胞总RNA行RT-PCR鉴定，也扩增出长度为0.66kb的GDNF基因片段，符合理论大小。 9.联合NSCs/GDNF-NSCs和壳聚糖套管治疗，能减少大鼠损伤侧脊髓运动神经元的死亡率，提高了神经元的存活率，促进损伤神经元胞体逆行轴浆运输及坐骨神经功能指数等的恢复，同时有利于新生神经纤维髓鞘的形成。且GDNF-NSCs效果优于NSCs。说明该治疗对外周神经损伤所导致的脊髓神经元死亡和退行性变有较好的保护作用，并对外周神经损伤后新生神经功能的恢复具有积极的促进作用。 l0.膜片钳全细胞记录脊髓前角神经元基本膜电生理特性显示，神经元被动膜电生理特性无显著变化；NSCs组与GDNF-NSCs组神经元动作电位阈值、时程与对照组比较存在显著差异。这些数据表明，在坐骨神经损伤后，神经元兴奋性增强，表现为产生动作电位的阈值降低、时程增长。通过移植NSCs和GDNF-NSCs治疗后这些指标较SAL组显著变化——更接近于未损伤的正常值，而且GDNF-NSCs组更优于NSCs组。 总之，通过我们的实验，联合应用基因工程细胞和组织工程材料治疗大鼠坐骨神经损伤，为坐骨神经的再生提供了所必需的三方面条件——营养物质、基质和神经细胞，并抑制了瘢痕等阻碍因素，使得移植后损伤神经的修复收到了较为显著的效果。同时基因修饰的NSCs因其自身表达分泌的GDNF因子，一方面可直接营养神经断端和神经元胞体，另一方面GDNF因子又促进NSCs的分化，更有利与神经再生，所以这种方法是较理想的治疗手段，具有一定的应用前景。

目录

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摘要

前 言

总材料与试剂

第一部分大鼠大脑皮层神经干细胞的分离培养及其与壳聚糖、雪旺细胞共培养的实验研究

材料及方法

结 果

讨 论

小 结

第二部分GDNF基因逆转录病毒表达载体的构建及基因转染神经干细胞的研究

材料及方法

结 果

讨 论

小 结

第三部分GDNF基因修饰的神经干细胞联合壳聚糖再生管治疗大鼠坐骨神经损伤的实验研究

材料及方法

结 果

讨 论

小 结

主要参考文献

照 片1

照 片2

致 谢

文献综述神经干细胞增殖分化的调节机制及其治疗神经系统疾病的研究进展

一、NSCs的生物学特性

二、NSCs增殖分化的调节机制

三、NSCs应用的研究进展

参考文献

学习期间发表和交流的文章