绿荧光蛋白转基因小鼠骨髓间充质干细胞诱导分化成内皮细胞的研究

摘要

血管组织工程(vesseltissueengineering)研究的重点问题之一是种子细胞，种子细胞来源缺乏是组织工程中的一大难题。内皮细胞作为种子细胞在血管组织工程研究中具有重要作用，如何获取足量的内皮细胞是目前有待解决的问题。骨髓间充质干细胞因具有取材方便、对机体无害、自体移植不存在免疫排斥问题以及分化类型广泛等突出优势而有望成为血管组织工程中种子细胞的新来源。骨髓间充质干细胞的分化机制和诱导条件目前尚未阐明。多数观点认为，其与骨髓间充质干细胞所处的微环境密切相关，可能是微环境中所含的各种因子促成了骨髓间充质干细胞向该环境所需要的细胞或组织分化。已有研究表明高表达的内皮细胞生长因子和血流剪切力在骨髓间充质干细胞向内皮细胞的定向分化中均有显著作用，但如何采用合理有效的诱导方式有待于进一步的探讨。 目的:研究绿荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)体外分离培养及扩增能力，探讨其骨髓间充质干细胞在不同诱导条件和方式下向内皮细胞定向分化能力，为在体研究提供实验基础。 方法:选用GFP小鼠作为研究对象，分离培养骨髓间充质干细胞，并在体外进行细胞的扩增和传代;应用VEGFcDNA质粒转染和直接添加VEGF的方法对骨髓间充质干细胞进行诱导，并比较两者对GFP小鼠骨髓间充质干细胞分化为内皮细胞的作用，对其结果进行免疫荧光检测，计算阳性细胞比例，统计分析。选出高效的诱导方式;分组诱导，实验分为3个实验组，即①切应力组：直接置于平行板流动腔内应用切应力(8dyn/cm2)诱导24h；②转基因诱导静止组：将MSCs细胞行VEGF质粒转染诱导培养；③转基因诱导切应力组：将MSCs细胞行VEGF质粒转染诱导后置于平行板流动腔内在切应力条件下(8dyn/cm2)诱导24h。之后再将各组细胞分别置于培养板培养1，3，5，7，10天，免疫荧光检测其分化效果。 结果:MSCs每扩增一代，细胞数量增加4～8倍，7.0×103个原代MSCs体外扩增3代即获得1.4×108个细胞。连续传代10代后仍可保持旺盛的分裂能力，说明GFP小鼠MSCs具有良好的体外的培养扩增的能力;直接添加浓度为25mg/1的VEGF诱导时，随着时间推移，vWF阳性细胞比例逐步上升，其转化率在添加诱导剂3d时达到高峰，而后逐步平稳下降。用免疫荧光法检测在添加诱导剂1、3、5、7、10d时MSCs分化为vWF阳性细胞比例分别为2.1％、23.3％、25.7％、23.5％、和21.8％。而经VEGFcDNA质粒转染骨髓间充质干细胞时，随着时间推移，vWF阳性细胞比例稳步上升，用免疫荧光法检测诱导1、3、5、7、10d时MSCs分化为vWF阳性细胞比例分别为1.3％、5.6％、14.4％、23.5％、和33.1％，其后期转化率明显高于直接添加VEGF的诱导组。以上结果说明，GFP小鼠骨髓间充质干细胞在VEGF的诱导下能有效地向内皮细胞转化，但随着时间的推移，其转化效果逐步降低。而通过VEGFcDNA质粒转染的方法使细胞自身表达VEGF，可持续有效地促进骨髓间充质干向内皮细胞转化;检测诱导后培养1，3，5，7，10天的切应力组细胞，结果显示在诱导3d时出现vWF表达阳性细胞，说明MSCs在流体切应力的作用下可以转化成内皮细胞。而转质粒诱导切应力组在转质粒诱导后，将MSCs移入平行板流动腔以8dyn/cm2的流切力诱导24h，(对照转质粒组继续静止培养24h)。培养1、3、5、7、10天后对其结果进行免疫荧光检测，计算vWF阳性细胞比例。用免疫荧光法检测分化为vWF阳性细胞比例分别为2.1％、7.3％、20.8％、38.0％、和63.2％，与对照组差异显著(P＜0.01)，说明在流体剪切力作用MSCs转化率明显高于对照组。结果表明，流体剪切力对骨髓间充质干细胞向内皮细胞转化有明显促进作用。 结论:GFP小鼠MSCs在VEGF作用下可以向ECs转化，其转化效果随着VEGF因子的降解而降低；而VEGFcDNA质粒转染的方法可长期有效地促进骨髓间充质干向内皮细胞转化;流体剪切力对骨髓间充质干向内皮细胞转化有明显促进作用。

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文献综述骨髓间充质干细胞的研究进展

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