甲氧化三丁基锡多终点遗传毒性评价和诱导细胞凋亡的分子机制研究

摘要

有机锡(Organotin)可强烈地杀灭真菌、虫体以及软体动物，自20世纪60年代开始作为涂料添加剂广泛用于防止海洋附着生物对船体、鱼网、钻井平台等的污损。三丁基锡(Tributyltin，TBT)是其中应用最多、效果最强的一类。然而由于其不断释放入周围水体并沉降入海泥中，对其它非目标性生物也产生了严重的生态环境危害。三丁基锡还是一种内分泌干扰物，可导致贝类畸形、牡蛎发育异常、腹足类动物性畸变(Imposex)。三丁基锡不仅对水生生物造成危害，而且可以通过食物链危害人类。有机锡对海洋的污染及其对海洋生物的毒性受到各国的关注，并被认为是迄今为止由人为因素而导致大量进入海水环境的毒性最大的化学品之一，许多国家政府纷纷采取措施限制和禁止有机锡在海洋中的使用，目前已被联合国环境保护署归入持久性有毒物质(Persistenttoxicsubstances，PTS)之一，国际海事组织已经规定2008年后停止使用。尽管人们可以减少三丁基锡从涂料中的释放量，但是三丁基锡能够在海泥中高浓度地保留许多年，尤其是在一些海湾地区。 对三丁基锡的研究报道多是关于免疫毒性和内分泌干扰作用的研究，对三丁基锡的遗传毒性以及毒作用机制的研究报道很少，而且多是关于水生生物。有研究者以贻贝(Mytilusedulis)和沙虫(Platynereisdumerilli)两种腹足软体动物为实验材料对三丁基锡进行了姐妹染色体交换试验、染色体畸变试验、彗星电泳试验及微核试验，发现其具有遗传毒性，但诱导遗传毒性的剂量与存活率的剂量非常接近，因此亟待采用其它种类的生物进行遗传毒性的研究。 每种遗传毒性评价试验都能反映特定的遗传学终点。但任何试验都不能反映全部的遗传学终点，因此，对化合物的遗传毒性评价需要进行试验配套，即采用遗传学终点相互互补的试验进行联合评价和研究。在配套试验中，应包括体内试验(invivo)和体外试验(invitro)、真核细胞试验和原核细胞试验。因此，为对三丁基锡进行较系统的遗传毒性评价，本研究以甲氧化三丁基锡(Tributyltin，TBTMO)为对象、采用了包括哺乳动物在内的、多遗传学终点的配套试验对三丁基锡的遗传毒性进行了评价，内容包括：小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(Ames试验)、小鼠脾淋巴细胞hprt基因突变试验、CHL细胞染色体畸变试验，并对急性毒性进行了实验研究。 细胞凋亡也称细胞程序性死亡(Programmedcelldeath，PCD)，是细胞内或细胞外的诱导因子所诱导的一种细胞主动“自杀”过程，也是化合物发挥细胞毒性的重要分子机制。有研究表明，三丁基锡对细胞和生物体均表现出强烈的毒性，并可诱导细胞凋亡。然而，凋亡过程中涉及复杂的信号转导因子和效应蛋白，并具有严格的时序控制性。不同的凋亡诱导因子可以通过不同的途径和机制诱导细胞凋亡。至今三丁基锡诱导凋亡的机制仍未完全确定。为此，本研究以人Jurkat淋巴瘤细胞为实验材料，对甲氧化三丁基锡诱导的磷脂酰丝氨酸的翻转、第二信号因子胞内钙离子的变化、是否通过线粒体途径(检测线粒体膜蛋白Apo2.7、线粒体膜电位(△ψm))、是否依赖于凋亡的重要效应器caspase-3和核DNA修复机制相关的PARP酶、细胞DNA断裂分析、对细胞周期的影响、诱导凋亡发生的细胞周期时相等多个凋亡通路节点和相关因子进行了研究。 小鼠淋巴细胞hprt基因突变分析试验是遗传毒性评价的重要方法，其独特的优点在于不仅能检测出突变剂的致突变能力大小，还可以进一步检测其分子突变谱。然而该试验是在96孔U型细胞培养板中完成，实验中需要在显微镜下观察和记录细胞克隆，但是非染色状态下细胞克隆在U型板中不易辨别。显微镜下人工判定是一项繁重而准确性欠佳的工作。 近年来，转基因动物在环境致突变研究方面得到了迅速发展和应用。究其原因，是因为转基因动物结合了目前体内外遗传毒理试验的主要优点。它既有一个明确的外源靶基因便于在动物染毒后可从任一感兴趣的特定靶器官或组织中分离和回收靶基因，并在体外进行精确的分子突变谱分析(体外试验的优点)；同时，它又可以整体动物染毒，能比较真实地反映诱变剂在体内的吸收、分布和代谢方面的特点(体内试验的优点)，因此，转基因动物是目前研究体内基因突变比较理想而且有效的工具。 GFP基因近年来广泛应用于细胞生物学，其表达产物GFP不需其它荧光素的标记即可发射绿色荧光。理论上GFP转基因动物用于hprt基因突变试验正好可以解决试验中细胞克隆不易观察的技术问题，是hprt突变试验的理想动物模型。为了更好地应用小鼠hprt突变试验对三丁基锡进行遗传毒性评价，本文对GFP转基因小鼠用作hprt基因突变试验动物模型进行了初步研究。 本研究共包括三个部分。主要结果如下： 第一部分：GFP转基因小鼠用作hprt基因突变试验动物模型的初步研究。 1.比较了GFP转基因小鼠和普通小鼠的微孔培养物在显微镜下的观察结果。结果显示GFP转基因小鼠的微孔培养物比普通小鼠易于确认，结果准确，前者优于后者。 2.观察了乙基亚硝基脲(ENU)诱导GFP转基因小鼠和普通小鼠后的动态外周血嗜多染红细胞和骨髓嗜多染红细胞的微核率变化。染毒方法为剂量50mg/kg、100mg/kg，每天1次、腹腔注射方式。诱导后小鼠外周血微核率在第3天迅速上升，在6天达到高峰，此后迅速降低，第21天时微核率已降至本底值的水平。两种小鼠的试验结果基本相同。 3.小鼠淋巴细胞刺激液的制备。结果显示其刺激小鼠淋巴细胞的增殖是有效的。 4.设计了GFP转基因小鼠的hprt基因的9个外显子PCR引物和mRNA的2个RT-PCR引物，并对其基因组DNA和总mRNA进行了验证性检测。结果显示GFP转基因小鼠的hprt基因是完整的，与其源系小鼠C57BL/6J相比未见有差异，提示这些引物序列设计是可行的，可进一步应用于GFP转基因小鼠hprt基因突变检测试验。 5.对ENU诱导后的突变模型进行了突变分析：ENU50mg/kg、100mg/kg(每天1次，共5次)诱导后脾淋巴细胞克隆效率(PE)明显下降，分别为8.6％和7.7％(对照组的PE为10.5％)，而hprt基因突变率(MF)显著上升，分别为8.2×10-6和11.4×10-6，分别是正常组的8.4倍和11.6倍。对6个突变克隆外显子1的测序结果均未见异常，而3个突变克隆的外显子9却发现其中有2个发生了A:T→T：A颠换(2/3)。 第二部分：甲氧化三丁基锡的一般毒性和遗传毒性评价。 1.小鼠急性毒性试验：甲氧化三丁基锡对小鼠的LD50为98mg/kg，其95％可信限为85mg/kg-113mg/kg，回归方程为Y(几率单位)=-5.97+5.507×LogD(D：剂量)，其剂量-死亡率关系为抛物线型。按化学品的毒性分级标准属中等毒性。急性中毒的死亡类型不是速死型，多在3-5天发生。在整个试验期内，甲氧化三丁基锡具有抑制小鼠体重增长的作用。 2.甲氧化三丁基锡小鼠具有遗传毒性。可导致小鼠精子畸形、睾丸的脏器系数降低。但Ames试验、CHL染色体畸变试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠脾淋巴细胞hprt基因突变试验均为阴性结果。 第三部分：甲氧化三丁基锡诱导人JurkatT淋巴瘤细胞凋亡的分子机制研究。 通过本课题的研究可以得出如下结论：①GFP转基因小鼠可作为小鼠脾淋巴细胞hprt基因突变试验的良好模型，具有准确性高、降低了试验难度等优点。GFP转基因小鼠对模式诱变剂ENU诱导外周血嗜多染红细胞的微核率与普通小鼠基本相同。结果证明了新方法是可行有效的。②甲氧化三丁基对小鼠的LDso为98mg/kg，按化学品的毒性分级划分标准属中等毒性，其剂量-死亡率关系为抛物线型，急性中毒的死亡不是速死型；甲氧化三丁基可抑制小鼠的体重增长，降低睾丸的脏器系数。③甲氧化三丁基锡具有一定的遗传毒性，可导致小鼠精子畸形，雄性生殖系统是其主要靶器官之一。但遗传毒理学试验Ames试验、CHL染色体畸变试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠脾淋巴细胞hprt基因突变试验为阴性结果。④甲氧化三丁基可通过线粒体途径诱导Jurkat人淋巴瘤细胞凋亡，钙离子是其中最初的信号因子；甲氧化三丁基阻滞Jurkat细胞于细胞周期的S期。凋亡事件包括磷脂酰丝氨酸外翻、caspase-3活化、PARP酶剪切、DNA断裂和片段化。

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摘要

前言

第一部分 GFP转基因小鼠用作hprt基因突变试验动物模型的初步研究

第二部分 甲氧化三丁基锡的一般毒性和遗传毒性评价

第三部分 甲氧化三丁基锡诱导Jurkat T淋巴瘤细胞调亡的分子机理研究

全文结论

致谢

参考文献

文献综述 小鼠淋巴细胞hprt基因突变检测的研究进展

博士研究生期间发表的论文

博士研究生期间编写的专著和教材

博士研究生期间获得的科研奖励