RNA干扰介导的VEGF基因沉默抑制结肠癌细胞增殖和肿瘤血管生成的实验研究

摘要

目的：结肠癌的恶性增殖受到多种因素的影响，其中肿瘤血管生长对肿瘤的生长起重要作用。血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)是一种重要的促血管形成因子，并且还能以自分泌的形式促进肿瘤细胞自身生长，在结肠癌的发展、转移及预后等方面均起着重要的作用。因此，阻断VEGF表达可抑制肿瘤血管生成和肿瘤细胞增殖，是结肠癌基因治疗的一项重要策略。VEGFmRNA经不同的剪切方式可得到7种不同的同工型，在人类细胞中其氨基酸残基数分别为121、145、148、165、183、189、206，其中VEGF165表达广泛，是最重要的效应分子。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是由双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)引发的转录后基因沉默机制(posttanscriptionalgenesilencing，PTGS)。利用RNA干涉(RNAi)技术可设计出针对VEGFmRNA165特异的siRNA序列，阻断基因表达具有高稳定、高效率和高特异的特点，可望成为肿瘤基因治疗的新手段。因此，设计、构建VEGF165特异的RNAi表达体系，分析表达体系对结肠癌细胞增殖和肿瘤血管生成的影响，对探索结肠癌基因治疗的新途径具有重要意义。 方法：第一部分：①针对VEGF165mRNA序列，筛选、设计、合成siRNA相关基因片段，构建高特异的siRNA表达载体pAVU6+27-VEGF165-siRNA，双酶切鉴定及测序验证插入序列的正确性。②脂质体法基因转染HCT116细胞，G418抗性筛选获得阳性克隆。半定量RT-PCR和Westernblot法验证siRNA阻断VEGF基因表达的效率。第二部分：①应用MTT比色分析法和流式细胞技术观察siRNA阻断VEGF基因表达后HCT116细胞增殖及细胞周期分布的影响；②建立重组体转染HCT116细胞的荷瘤裸鼠模型，观察肿瘤生长情况；应用免疫组化法观察肿瘤血管生成和VEGF表达的改变。 结果：①成功构建针对VEGF165mRNA序列siRNA表达载体：pAVU6+27-VEGF165-siRNA。②重组子脂质体法转染HCT116细胞，经G418筛选获得阳性克隆细胞，RT-PCR和WesternBlot检测靶细胞VEGF-mRNA及VEGF蛋白表达较对照组明显下降，其受抑制率分别为71.2％和66.6％(P＜0.01)。③MTT分析结果显示实验组人结肠癌细胞的生长被明显抑制，细胞周期分布分析提示G0/G1期细胞比例增高，另一方面S期和G2/M期细胞比例降低，RNA干扰重组体明显促进肿瘤细胞G0/G1期阻滞作用。④重组体转染HCT116细胞荷瘤裸鼠肿块的体积和重量明显小于对照组(P＜0.05)，肿瘤组织中VEGF的表达和微血管密度明显低于对照组并且两者成正相关(r=0.810，P＜0.01)。 结论：①应用表达载体法成功构建VEGF基因特异的siRNA干扰表达体系pAVU6+27-VEGF165-siRNA。②pAVU6+27-VEGF165-siRNA经脂质体法转染靶细胞后能稳定显著地发挥基因沉默作用。③pAVU6+27-VEGF165-siRNA转染靶细胞后细胞增殖明显受到抑制，裸鼠荷瘤模型中肿瘤生长、肿瘤组织血管生成及VEGF表达明显受到抑制④为进一步开展结肠癌基因治疗提供了理论及实验依据。

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摘要

前言

第一部分VEGF165特异的siRNA表达载体构建、鉴定及沉默效率检测

第二部分VEGF基因沉默对结肠癌细胞增殖和肿瘤血管生成的影响

全文结论

致谢

附图

参考文献

文献综述

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