超声介导脂质体微泡对大鼠血管平滑肌细胞生物学行为影响的研究

摘要

背景和目的：血管新生内膜形成是经皮冠状动脉介入治疗(PCI)后再狭窄(RS)的病理基础。血管内皮损伤后，中膜的血管平滑肌细胞(VSMC)在多种生长因子、细胞因子、炎症介质的作用下，由收缩型转化为合成型，并向内膜下迁移，发生过度增殖则是新生内膜形成的关键环节。此外，介入术后早期VSMC凋亡相对不足，增殖与凋亡之间平衡失调，也是RS发生的重要机制。因此，如何有效抑制VSMC细胞增殖和迁移、调节VSMC增殖与凋亡之间的平衡，已成为RS防治的重点。目前的防治方法主要有口服抗血小板药、他汀类药、抗增殖药等药物，血管内放射治疗，转基因治疗和药物涂层支架，但均不能完全解决新生内膜增生的问题。近年来，有关将超声介导微泡技术引入超声治疗的研究进展十分迅速。超声空化效应本身对周围组织细胞可产生各种生物学效应，如抑制细胞增殖、迁移、粘附，促进细胞凋亡等，这些生物学效应可用于临床治疗的各个方面；超声造影剂作为一种人为的空化核，不仅降低超声的空化阈值，增强空化效应，并减少产生空化效应所需的超声能量，还可作为携带药物、蛋白和基因的载体，并利用超声击破微泡，实现药物的靶向导入和释放。因此，如果能将微泡造影剂的靶向载体功能和超声空化效应本身的生物学效应有机地结合起来，将为临床防治RS开辟一个新途径。本研究拟制备一种包载紫杉醇的脂质体微泡造影剂，研究超声介导载紫杉醇脂质体微泡对体外培养的大鼠VSMC增殖、迁移、凋亡以及表型转化的影响，并对其机理进行探讨。 方法：(1)采用组织块贴壁法原代培养大鼠主动脉VSMC。(2)通过台盼蓝排斥试验评价超声介导脂质体微泡对VSMC的安全性。(3)采用冷冻干燥法制备携带紫杉醇的脂质体微泡造影剂，在光镜和荧光显微镜下观察其形态和大小以及紫杉醇在微泡上的定位，用Zetasizer3000和pH计检测载紫杉醇脂质体微泡的粒径和粒度、表面电位、pH值，应用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)检测紫杉醇的包封率，通过台盼蓝排斥试验评价载紫杉醇脂质体微泡的安全性。(4)应用四唑盐(MTT)比色试验、流式细胞术、millicell小室和AnnexinV-FITC/PI双标染色分别检测超声介导空白脂质体微泡和超声介导载紫杉醇脂质体微泡对VSMC增殖、迁移和凋亡的影响。(5)应用免疫细胞化学、免疫荧光化学、荧光细胞化学、荧光探针和激光共聚焦技术观察超声介导脂质体微泡和超声介导载紫杉醇脂质体微泡对VSMC的增殖细胞核抗原(PCNA)、p27、细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、Bcl-2、Bax、肌动蛋白丝(F-actin)、纽带蛋白(vinculin)、β-微管蛋白(β-tubulin)、波形蛋白(vimentin)的表达以及细胞内Ca2+浓度的影响；(6)通过RT-PCR、westernblot和免疫细胞化学技术检测分析超声介导脂质体微泡和超声介导载紫杉醇脂质体微泡对VSMC表型标志基因SMα-actin和SMemb的蛋白及mRNA表达的影响。 结果：(1)采用组织块贴壁法原代培养大鼠主动脉VSMC，经细胞形态学和免疫荧光化学鉴定证实为VSMC。(2)1MHz的连续波超声，单纯超声辐照在声强小于0.8W/cm2，超声介导脂质体微泡(1μl/ml)在声强小于0.4W/cm2时，对VSMC无明显的毒性作用；(3)采用冷冻干燥法成功制备载紫杉醇脂质体微泡，其平均粒径为2.79μm(2～10μm)，表面电位-5.9，pH值5.54，包封率为36.1±4.74％，对VSMC无毒性作用。(4)以声强为0.5W/cm2的超声辐照60s，声强为0.3W/cm2的超声介导脂质体微泡辐照30s时，VSMC吸光度显著降低(P＜0.05)，超声介导微泡组辐照60s时吸光度降低最大(P＜0.01)；超声介导载紫杉醇脂质体微泡组和单纯载紫杉醇脂质体微泡组VSMC吸光度均较血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)组显著降低(P＜0.01)；超声介导载紫杉醇脂质体微泡组VSMC吸光度明显低于超声介导脂质体微泡组和单纯载紫杉醇脂质体微泡组(P＜0.05)。(5)超声介导脂质体微泡组、超声介导载紫杉醇脂质体微泡组和单纯载紫杉醇脂质体微泡组S期细胞比例均较PDGF组显著降低(P＜0.01)，超声介导脂质体微泡组G0-G1期细胞显著增多(P＜0.01)，单纯载紫杉醇脂质体微泡组G2-M比例显著增高(P＜0.01)，超声介导载紫杉醇脂质体微泡组G0-G1期和G2-M期细胞比例均显著增高(P＜0.01)；超声介导载紫杉醇脂质体微泡组S期细胞比例较超声介导空白脂质体微泡组和单纯载紫杉醇脂质体微泡组均显著降低(P＜0.01)。(6)0.3W/cm2的超声介导脂质体微泡辐照60s时，VSMC迁移数显著减少(P＜0.05)，辐照120s时，VSMC迁移数减少达最大；超声介导载紫杉醇脂质体微泡组和单纯载紫杉醇脂质体微泡组VSMC迁移数均显著降低(P＜0.01)；超声介导载紫杉醇脂质体微泡组VSMC迁移数明显低于超声介导脂质体微泡组和单纯载紫杉醇脂质体微泡组(P＜0.01)。(7)单纯超声辐照组和超声介导脂质体微泡组呈时间依赖性诱导VSMC凋亡，辐照时间为120s时，细胞凋亡比例达峰值，分别为10.81％和20.32％；超声介导载紫杉醇脂质体微泡组与超声介导脂质体微泡组之间VSMC凋亡比例无显著差异(P＞0.05)；单纯载紫杉醇脂质体微泡组对VSMC凋亡比例无明显影响(P＞0.05)。(8)超声介导脂质体微泡组、超声介导载紫杉醇脂质体微泡组以及单纯载紫杉醇脂质体微泡组VSMCPCNA蛋白表达阳性率显著降低(P＜0.01)，其中以超声介导载紫杉醇脂质体微泡组更为明显；超声介导脂质体微泡组和超声介导载紫杉醇脂质体微泡组CDK2表达减少、p27表达增高(P＜0.01)；单纯载紫杉醇脂质体微泡组CDK2、p27表达无明显变化(P＞0.05)。单纯超声辐照组、超声介导脂质体微泡组和超声介导载紫杉醇脂质体微泡组VSMCBax表达显著增高，而Bcl-2表达明显降低(P＜0.05，P＜0.01)；单纯载紫杉醇微泡组Bax和Bcl-2表达无明显变化。(9)超声介导脂质体微泡组，F-actin、vinculin表达减少，β-tubulin和vimentin解聚；超声介导载紫杉醇微泡组和单纯紫杉醇微泡组F-actin、vinculin、β-tubulin有边集现象，vimentin表达和分布无明显改变。(10)超声介导脂质体微泡组、超声介导载紫杉醇微泡组和单纯载紫杉醇微泡组均可减轻VSMC细胞内Ca2+超载(P＜0.01)，其中以超声介导载紫杉醇脂质体微泡组更为明显。(11)超声介导脂质体微泡组可显著抑制VSMC合成型标志基因SMemb蛋白及mRNA表达(P＜0.01)，并逆转血清诱导的收缩型标志基因SMα-actin蛋白及mRNA的表达下调(P＜0.01)；单纯载紫杉醇微泡组SMemb和SMα-actin蛋白及mRNA的表达无明显变化(P＞0.05)。 结论：(1)用冷冻干燥法成功制备了表面带负电荷的载紫杉醇脂质体微泡超声造影剂，粒径大小符合静脉注射要求，体外细胞毒性试验证实了该超声造影剂的安全性。(2)超声介导脂质体微泡、超声介导载紫杉醇脂质体微泡和单纯载紫杉醇脂质体微泡均可明显抑制PDGF-BB所致的VSMC增殖、迁移，其中以超声介导载紫杉醇脂质体微泡的作用最为显著。(3)超声介导脂质体微泡、超声介导载紫杉醇脂质体微泡可诱导VSMC凋亡，单纯载紫杉醇脂质体微泡对VSMC凋亡无影响。(4)超声空化脂质体微泡可显著抑制血清刺激诱导的VSMC表型标志基因的改变，对VSMC表型转化有明显的逆转作用。超声介导载紫杉醇脂质体微泡逆转VSMC表型转化是超声空化微泡的结果，紫杉醇本身对VSMC表型的转化无显著影响。

目录

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主要英文缩写词简表

摘要

前言

第一部分超声介导脂质体微胞对血管平滑肌细胞增殖、迁移和凋亡的影响及其机制探讨

第二部分载紫杉醇脂质体微泡的制备及其质量、安全性的研究

第三部分超声介导载紫杉醇脂质体微泡对VSMC表型转化、增殖、迁移和凋亡的影响及其机制探讨

全文结论

致谢

参考文献

文献综述一冠状动脉支架内RS的研究进展

文献综述二超声微泡造影剂在基因转移中的应用

攻读学位期间文章发表情况