荧光原位杂交技术在食管癌研究中的应用及环氧合酶-2与食管癌的相关性研究

摘要

食管鳞状细胞癌是我国北方地区高发的食管鳞状上皮来源的恶性肿瘤。尽管近年来肿瘤的综合治疗措施取得了较大进展，但食管癌患者的生存率并未得到明显改善。目前研究表明，食管癌发病是一个多因素、多阶段、多基因参与的复杂过程。食管癌的细胞与分子遗传学研究为揭示其发病机理提供了有益的线索。 染色体畸变是肿瘤细胞的显著特征之一。在众多研究染色体畸变的细胞及分子遗传学方法中，荧光原位杂交以其灵敏性好、特异性强、信号-噪声比高，并可以鉴定染色体结构和数目异常，成为现代肿瘤遗传学研究中最为常用的技术手段之一。 本研究从染色体水平、染色体区带水平和基因水平三个层次，探讨了荧光原位杂交技术在食管癌研究中的应用。为了研究食管癌细胞的全染色体畸变，本研究利用重复多色荧光原位杂交技术，将24条特异性的染色体(22条常染色体和2条性染色体)涂染探针，分别用Cy3、Cy5、FITC和DEAC四种荧光素按一定组合直接标记，制备两组十二色的探针池，对细胞系KYSE140的同一染色体片先后两次杂交，进行全染色体畸变分析。为了探讨同一染色体臂上不同区带的非同步性改变，采用多色荧光原位杂交方法，用Cy3、Cy5和FITC三种荧光素分别标记3q、8q、11q上的三个区带，检测这些区带在细胞系EC9706的扩增或畸变。最后，在常规FISH技术的基础上，我们设计了一种新的制片方法，建立间期核阵列；然后利用基因特异性BAC探针，检测Nek2和Hec1基因在食管癌组织标本中的扩增情况。 通过本研究发现，在细胞系KYSE140中，大部分染色体都出现了异常改变。其中1、2、3、7、8号染色体存在明显的扩增，11、13和18号染色体均有一条丢失。检测到19个衍生染色体，其中多数是由两条染色体的部分区段构成；有3个衍生染色体涉及到了3个不同的染色体。通过对细胞系EC9706三条染色体长臂的分析，发现3号染色体长臂扩增且末端发生了易位，8号染色体长臂末端出现了扩增，11号染色体长臂1区出现了扩增。我们建立的间期核阵列FISH技术，可以快速有效地检测基因扩增；在61例食管鳞状细胞癌组织标本中，38例标本出现Nek2基因的扩增，总扩增率为62.3％，17例标本出现Hec1基因的扩增，总扩增率为27.9％，但是没有发现Nek2和Hec1基因的扩增与临床病理参数之间存在相关关系。 食管癌发病及其进展涉及了多个基因和蛋白，环氧合酶-2是近些年来研究较多的一个。它是前列腺素合成过程中的一个重要限速酶；在正常生理情况下，绝大多数组织细胞并不表达环氧合酶-2；但是它可以在内外刺激因素的作用下，出现早期快速诱导性表达。 为了探讨环氧合酶-2与食管癌的相关性，本研究用免疫组织化学的方法，检测了环氧合酶-2在食管癌组织标本的表达情况；用真核表达型质粒转染小鼠胚胎成纤维细胞系NIH3T3，观察环氧合酶-2对正常细胞的恶性转化能力；用正义和反义核酸分别转染细胞系EC9706，观察环氧合酶-2对细胞生长、细胞周期和致瘤性的影响。 研究发现，在检测的69例食管鳞癌临床标本中，31例出现了环氧合酶-2的高表达，与正常食管上皮组织有显著性差异；环氧合酶-2在高分化鳞癌中的表达率为69.6％，高于其在低分化和中分化鳞癌中的表达(表达率分别为38.2％和16.7％)；环氧合酶-2在食管癌的表达与临床病理分期存在正相关(P=0.045)。转化NIH3T3细胞系的研究表明，环氧合酶-2导入后，在软琼脂集落形成实验并没有出现细胞克隆。用正义和反义核酸分别转染细胞系EC9706后，转染细胞的生长曲线并未发生改变，反义转染细胞的G1期细胞比例降低，在软琼脂集落形成实验中，生长的细胞克隆数目较空转和正义核酸转染细胞为少。 综上所述，可以得到如下结论：(1)重复多色荧光原位杂交技术能够用于全染色体畸变分析；应用区带特异性探针可以发现同一染色体臂内不同区带的非同步变化；应用间期核阵列荧光原位杂交技术检测基因扩增具有简单、易行、节约、快速的优点；Nek2基因在食管鳞癌存在高频扩增，对Nek2基因的异常表达可能起有一定作用；(2)环氧合酶-2在食管癌变和进展中起有一定作用，但其单独并不能转化正常细胞；环氧合酶-2可以将细胞周期阻滞在G1期，其表达可以增强肿瘤细胞的恶性行为。

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英文缩略语对照表

摘要

前言

第一部分 FISH技术在食管癌研究中的应用

第二部分 COX-2与食管癌的相关性研究

参考文献

文献综述一FISH技术进展及其应用

文献综述二环氧合酶-2与癌变机理研究

图片与说明

攻读博士期间发表的文章

致谢