金黄色葡萄球菌氨基糖苷类、喹诺酮耐药基因的研究

摘要

目的：
　　金黄色葡萄球菌[Staphylococcus aureus(SA)]是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎及败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌是院内感染的常见细菌之一，许多国家都设有专门机构，应对金葡菌的院内感染问题。随着内酰胺类抗生素的广泛应用，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)随之增加，且引起的感染和病死率有逐年增加的趋势。MRSA可通过接触途径进行传播，即易感人群从携带者或感染者身上获得 MRSA，导致传播流行。腺苷酰转移酶是一种跨膜多重药物外排蛋白，介导了葡萄球菌对氨基糖苷类药物(主要是亲水性氨基糖苷类药物)及多种结构上近似甚至无关的药物耐药。该菌对多种广谱抗菌药物耐药，给临床治疗带来很大困难。因此，对其耐药机制、耐药基因的传播与转移的研究具重要的临床意义。
　　本研究首次对临床分离SA氨基糖苷类耐药基因adenylyltransferase gene、氟喹诺酮耐药基因NorA进行克隆、测序、表达及初步功能研究，为进行Adenylyltransfe rase、NorA蛋白高级结构测定的结晶试验提供必须材料，同时对耐药基因的深入功能研究奠定基础，为从分子水平开展医院SA耐药株感染的控制和监测提供依据。
　　方法：
　　取SA临床分离株复苏、鉴定。采用离心柱型DNA抽提纯化试剂盒提取SA染色体DNA，根据Genbank公布的SA基因序列设计特异性引物，以染色体DNA为模板，通过 PCR技术扩增 adenylyltransferase、NorA全基因，PCR产物纯化后与pGEX-4t-1载体连接，连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α，挑取经氨苄筛选的阳性菌落提取质粒并经双酶切及测序鉴定。转化大肠杆菌E.coli BL21，经双酶切鉴定后以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组菌表达，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及免疫印迹法（Western blot）分析表达结果；并对pGEX-4T-1-adenylyltransferase/BL21重组株进行氨基糖苷类类药敏实验。另收集临床分离的22株金黄色葡萄球菌，采用PCR法检测adenylyltransferase、NorA基因的携带率。
　　结果：
　　复苏的细菌经再鉴定确定为SA，以SA染色体DNA为模板，PCR扩增出两个大小分别约783bp、1167bp左右的片段并将其成功克隆入T载体。序列比对分析显示adenylyltransferase开放阅读框长783bp，编码29.9kDa蛋白；NORA开放阅读框长1167bp，编码43.9kDa蛋白。成功构建高效表达载体pGEX-4T-1-adenylyltransferase/NORA，经IPTG诱导分别获得分子量约55kDa、69kDa的融合表达蛋白，与预期分子量相符。重组体大肠杆菌药敏结果显示，pGEX-4T-1-NORA/BL21的MIC与pGEX-4T-1/BL21相比仅CIP有2级浓度差异，其余结果一样。22株金黄色葡萄球菌中检出腺苷酰转移酶耐药基因9株，检出率为40％； NORA基因12株，检出率为45%。
　　结论：
　　成功构建了金黄色葡萄球菌氨基糖苷类耐药基因adenylyltransferase、耐氟喹诺酮耐药基因NorA的T载体及高效原核表达载体pGEX-4T-1-adenylyltransferase/NorA/并获得2个重组蛋白的大量表达；重组体大肠杆菌药敏结果显示，pGEX-4T-1-NORA/BL21的MIC与pGEX-4T-1/BL21相比仅CIP有2级浓度差异，其余结果一样。22株临床分离金黄色葡萄球菌携带adenylyltransferase、 NORA基因的比率分别为45%、40%。

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前言

第一章 金黄色葡萄球菌腺苷酰转移酶耐药基因与氨基糖苷类耐药的相关性研究

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.3 结 果

1.4 讨 论

1.5小 结

第二章 金黄色葡萄球菌氟喹诺酮NORA耐药基因的克隆与表达

2.1 材料与方法

2.2 实验方法

2.3 结 果

2.4 讨 论

2.5 小 结

第三章 广州地区金黄色葡萄球菌感染的临床分布及耐药性分析

3.1 材料与方法

3.2 结 果

3.3 讨 论

3.4 小 结

结论

参考文献

综述: 金黄色葡萄球菌耐药性机制研究进展

附录：缩略词

致谢

攻读学位期间发表的论文