膀胱起搏细胞初探：成年豚鼠膀胱ICC样细胞的形态鉴定和电流特性研究

摘要

生理条件下，在体膀胱可记录到起源于膀胱顶，向膀胱颈方向传播的自发性、规律性慢波，推测在膀胱顶存在有起搏细胞；逼尿肌不稳定表现为病理状态下的全膀胱或大部分膀胱组织协调收缩，提示膀胱存在有一个兴奋性最高的控制点(即起搏点)。而离体的膀胱平滑肌肌条在完全阻断了神经影响(切断神经支配以及加入神经阻滞剂)的情况下，仍然存在有节律的自发性收缩。该现象表明离体膀胱平滑肌的收缩不依赖于神经因素而与膀胱平滑肌本身特性有关，是一种由起搏细胞控制的肌源性的自发兴奋、收缩。理论上存在的膀胱起搏细胞目前仍是未解之迷，尚未见明确说法。 卡哈尔间质细胞(interstitialcellsofCajal，ICC)在胃肠道的起搏作用和膀胱逼尿肌与胃肠道平滑肌相似的生理特性，为我们探求膀胱起搏细胞提供了一个理想的切入点。采用ICC特异鉴定方法——KIT免疫组织化学染色，KIT阳性、形态与胃肠道ICC相似的ICC样细胞被证实存在于豚鼠和人的膀胱，且推测其可能就是膀胱的起搏细胞。但目前相关研究报道较少，且集中于形态学研究，尚没有ICC样细胞就是膀胱起博细胞的证据。本课题以成年豚鼠为研究对象，在证实ICC样细胞存在于豚鼠膀胱的基础上，采用酶消化法，体外得到培养状态下的ICC样细胞，利用膜片钳技术，在全细胞记录模式下观察其是否具有起博细胞的电流特性，以证明其是否为膀胱的起博细胞。本研究结果将丰富膀胱神经生理理论，对于理解与排尿有关的生理和病理生理机制都会增加全新的认识，并为临床上治疗某些疾病(如DI)提供新的靶点。 主要实验结果及结论如下： 1.建立了能有效观察膀胱ICC样细胞的免疫组织化学实验方法：采用改良的国外学者制备膀胱铺片方法，通过KIT免疫组织化学染色技术，证实在成年豚鼠膀胱的粘膜下层和逼尿肌肌束边缘存在有ICC样细胞。 2.建立了膀胱ICC样细胞体外原代培养方法：采用酶消化法得到原代培养状态下的膀胱ICC样细胞和逼尿肌细胞；采用liberase胶原酶较传统胶原酶可明显缩短成年豚鼠膀胱ICC样细胞和逼尿肌细胞原代培养的组织消化时间。 3.体外培养状态下，ICC样细胞和逼尿肌细胞存在明显差别：(1)形态差别：ICC样细胞在培养状态下的形态和组织切片相似，胞体均为梭形，胞体两极有两个细胞突起；逼尿肌培养状态下呈成纤维样生长，细胞突起不规则。用免疫组织化学方法，可鉴定和区别这两类细胞：ICC样细胞KIT染色阳性，α-SM-Actin染色阴性；逼尿肌细胞KIT染色阴性，α-SM-Actin染色阳性。(2)增殖情况差别：成年豚鼠膀胱ICC样细胞在原代培养状态下细胞数目无明显增加；相同培养条件下的逼尿肌细胞增殖速度明显快于ICC样细胞，约7天以后即可传代。 4.建立了简单、有效的ICC样细胞纯化方法：由于逼尿肌细胞属于平滑肌细胞，贴壁能力相对弱于其它类型的细胞(接种后24小时)；而ICC样细胞贴壁能力明显强于逼尿肌细胞(接种后3小时即可贴壁)。利用培养初期两种细胞贴壁能力的差异，在混合培养中，ICC样细胞贴壁后将尚未贴壁、漂浮的平滑肌细胞转移至另一培养瓶中，在培养初期即可分离两种细胞，分别得到相对纯化的ICC样细胞和逼尿肌细胞。与免疫磁珠分选法相比，实验步骤更为简单和经济。 5.膜片钳技术能够精确直观地对细胞膜离子通道活动进行分析，直接得到有关细胞跨膜电位及电流变化信息。采用膜片钳技术，在全细胞记录模式下，首次记录到成年豚鼠膀胱ICC样细胞具有起搏细胞的特征电流Ih，提示ICC样细胞在膀胱可能起着起搏作用。Ih特异性阻断剂ZD7288对ICC样细胞Ih有明显抑制作用，并呈剂量依赖性。在相同记录模式下，逼尿肌细胞记录不到Ih。 6.采用膜片钳技术，在全细胞记录模式下，ICC样细胞和逼尿肌细胞内、外向电流组成成分明显不同，有关ICC样细胞内外向电流成分的分析和与逼尿肌细胞之间差异性的意义有待进一步深入研究。

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摘要

前言

第一部分：成年豚鼠膀胱ICC样细胞的形态学研究

第二部分：成年豚鼠膀胱ICC样细胞的体外培养

第三部分 ICC样细胞的电流特性研究

全文结论

致谢

照片

参考文献

文献综述一泌尿系统“ICC样细胞”基础研究状况与临床意义展望

文献综述二膀胱起搏

在读期间以第一作者撰写论文情况