长循环脂质超声造影剂“脂氟显”的制备优化及评价

摘要

研究背景： 新型超声造影剂的制备及应用研究是近年来超声医学研究的热点和前沿。超声造影剂是一种含有高浓度微气泡的混悬液，与CT、MRI造影剂类似，超声造影剂可以增强血流与周围组织的回声对比，明显改善超声影像对组织血流灌注的评价，显著提高超声诊断的敏感性和特异性，进一步拓展超声诊断领域，使超声诊断由“平扫时代”进入“增强时代”，被誉为超声诊断领域的第三次革命。此外，超声造影剂在超声分子成像以及介入治疗方面还有更大的应用潜力，如：通过在造影剂表面结合特异性配体制备靶向超声造影剂；或利用超声造影剂微泡携带基因或药物，介导基因转移或药物靶向治疗等。为此，国外医疗机构预测，超声造影剂不久将成为超声诊断或治疗中的常用试剂，具有巨大的社会效益和经济价值。 超声造影剂的发展经历了从空气微泡到氟碳微泡、从白蛋白微泡到脂质微泡的进步，目前的发展趋势是脂质或多聚体作为成膜材料、亚微米级或纳米级氟碳微泡、稳定性好、体内循环时间长。 我国在超声造影剂的研究方面起步较晚、发展较缓，因此，无论是技术、专利，还是市场，目前大部分被欧美公司所垄断。在市场方面，目前国外已有多种产品上市，包括美国的Optison、Definity和Imageat，欧洲的SonoVue等；而国内没有自主上市的超声造影剂，SonoVue是目前国内唯一可以用于临床的超声造影剂，但价格昂贵，而且造影增强时间较短。 “脂氟显”是我科自主研发的国内第一个脂质氟碳超声造影剂。它是在国外新一代脂质超声造影剂的基础上，通过对脂质材料及制备工艺进行创新性改进后研制成功的，具有完全自主知识产权。初步实验结果显示，“脂氟显”具有微泡产出率高、使用剂量小、造影效果优异、持续时间长等特点，尤其在造影增强时间方面效果显著，在肝、肾的持续时间长达30 min以上，优于国内外多种超声造影剂，具有很大的开发应用价值。但“脂氟显”只是实验室的初试产品，很多工艺尚不成熟，表现为：工艺重现性较差，配方及制备工艺未优化，工艺流程不完善等。此外，“脂氟显”的声学特性、应用价值及方法学、应用的安全性等也有待进一步研究。 研究目的： 1．对“脂氟显”的配方、制备工艺进行改进、优化和完善，以克服工艺重现性较差等不足，为其下一步商品化打下良好的基础； 2．对改进、优化后的“脂氟显”的理化性状、声学特性进行评价； 3．进一步探讨“脂氟显”的应用价值，包括常规增强显像、靶向诊断和介入治疗等方面。 4．对“脂氟显”应用的安全性进行评价，包括作为静脉注射药物的安全性，以及与诊断超声联合作用的安全性等。 主要方法及技术路线： 1．采用单因素分析或均匀设计等方法，对“脂氟显”制备的各个环节逐一进行考查，分析影响因素，分别进行改进、优化和完善； 2．采用光镜、透射电镜、激光粒度分析仪和Coulter颗粒计数仪等对“脂氟显”微泡的一般性状、稳定性进行评价，包括微泡的形态、粒径及分布、浓度、黏度、pH值、表面电位等； 3．采取稳定性加速试验，对脂质冻干粉剂的稳定性进行研究； 4．体外条件下，根据不同机械指数超声辐照前后“脂氟显”造影图像灰阶值的变化，对微泡的耐压性进行研究； 5．采用低机械指数实时造影显像技术，观察“脂氟显”对实验动物正常肝脏、心腔、心肌的造影增强效果以及肝、肾VX2肿瘤的诊断价值； 6．采用宽带谱分析方法、Church模型方程等对“脂氟显”微泡的粘弹特性和非线性特性进行研究； 7．分别采用共价结合法和黏附法制备携RGDS的靶向微泡造影剂，上述同样方法对微泡的一般性状进行评价后，采用荧光显微镜、流式细胞仪对比观察两种方法所制备的靶向微泡RGDS的结合率及结合的牢固程度； 8．采用冷冻干燥法制备载紫杉醇的脂质微泡造影剂，上述同样方法对微泡的一般性状进行评价后，采用荧光显微镜观察紫杉醇与微泡是否结合、结合的部位，以反相高效液相色谱法(RP-HPLc)检测紫杉醇的包封率； 9．通过急性毒性试验、静脉用药的溶血性、血管刺激性试验、热原反应以及血流动力学试验等，对“脂氟显”作为药物单独应用(即不合并超声辐照)时的安全性进行评价； 10．以伊文思蓝作为血管通透性改变的示踪剂，并通过甲酰胺淬取出组织中伊文思蓝，检测其量的变化，以人体最敏感、也是最重要的心、脑血管作为研究对象，研究诊断超声和“脂氟显”联合作用时对血脑屏障以及心肌血管通透性的影响； 11．以大鼠空间记忆能力的变化作为脑高级神经功能改变的评价指标，评价“脂氟显”和诊断超声联合作用开放血脑屏障后对大鼠神经行为的影响。 主要结果及结论： 1．通过采用机械振荡法取代超声振荡法，改进初次水合时脂质混悬液的制备，优化脂质混悬液的冻干工艺，优化配方等步骤，不仅使“脂氟显”的制备流程更加简化、完善，工艺重现性明显改善，而且微泡的性状更加优异。突出表现在：(1)微泡的产率明显提高；(2)微泡的粒径及粒径分布更趋理想，从以往单纯的微米级微泡变成含部分纳米级微泡的亚微米级微泡；(3)微泡的耐压性更好；(4)微泡的稳定性增加；(5)微泡在体内的循环时间明显延长。 2．改进、优化后“脂氟显”微泡溶液的共振频率在2.3 MHz左右，估计微泡的粘弹特性为G<,S>=10MP<,a>,d<,Se>=0.1％R<,0>,μ<,S>=1.49N·S/m<'2>。此结果从理论上评价和解释了“脂氟显”微泡所表现出来的优异理化性状。 3．改进、优化后“脂氟显”微泡在一定声压激发下可以产生次谐波信号；次谐波的发展大致经过三个阶段：产生、增长和饱和；在外加声压增大和减小的过程中，次谐波分量幅度曲线会出现回滞现象。“脂氟显”微泡在一定声压激发下可以产生次谐波信号的特性，预示着“脂氟显”微泡在超声成像以及超声检测方面有更好的应用前景。 4．改进、优化后“脂氟显”微泡能长时间增强实验犬心腔、心肌的灰阶显像，其中对心腔的目测增强持续时间达1 h以上，是一种长循环的亚微米级超声造影剂；“脂氟显”造影后，实验兔肝、肾VX2肿瘤的检出率明显提高，尤其提高了对肝、肾微小肿瘤的检出能力；利用“脂氟显”微泡可以结合特异性配体或携带药物，在方法学上，采用共价结合法比黏附法可以大幅度提高微泡与特异性配体的结合率以及结合的牢固程度。这些研究结果表明，“脂氟显”不仅在常规增强显像方面具有很大的优势，而且在靶向诊断和介入治疗方面有更大的应用潜力。 5．大剂量“脂氟显”微泡经静脉注射后对家兔红血球无溶血和凝集作用，无任何血管刺激性及热原反应发生，对左心室压、右心室压、心率也无明显影响；半数致死量测定试验中，注射剂量达常规使用剂量500倍时，小鼠也无一死亡，最大耐受量试验也未见明显异常反应和死亡，其毒性基本等同于生理盐水，完全符合药物安全性评价标准，安全阈值很宽，静脉用药十分安全。 6．采用“脂氟显”进行经颅脑超声造影时常规剂量注射，或心脏超声造影检查时常规剂量5倍的剂量注射，即使采用最高输出强度的诊断超声辐照10 min，也不导致大鼠血脑屏障或心肌血管通透性的任何改变。因此，应用“脂氟显”进行常规造影检查是非常安全的。 7．较大剂量“脂氟显”造影剂注射结合较高机械指数的诊断超声辐照可以可逆性的、选择性的开放大鼠的血脑屏障，其对血脑屏障的开放时间长达4 h以上，且不导致大鼠神经行为及脑细胞形态学的改变。

目录

论文说明：主要英文缩写词一览表

声明

摘要

前 言

第一部分“脂氟显”制备工艺的改进、优化及理化性质的评价

材料与方法

结 果

讨论

小 结

参考文献

第二部分“脂氟显”微泡的粘弹特性和非线性振动特性的研究

材料与方法

结 果

讨论

小 结

参考文献

第三部分“脂氟显”的应用价值及方法学探讨

分题一“脂氟显”增强心脏显像的实验研究

材料与方法

结 果

讨论

分题二“脂氟显”对实验兔肝、肾VX2肿瘤造影的实验研究

材料与方法

结 果

讨论

分题三利用“脂氟显”微泡结合特异性配体或携带药物的研究

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

参考文献

第四部分“脂氟显”的安全性评价

分题一“脂氟显”单独应用时的安全性评价

材料与方法

结 果

讨 论

分题二“脂氟显”经颅脑超声造影对大鼠血脑屏障通透性及血脑屏障开放对神经行为影响的研究

材料与方法

结 果

讨论

分题三诊断超声和诊断剂量“脂氟显”联合作用对心肌血管通透性影响的实验研究

材料与方法

结 果

讨论

小 结

参考文献

全文总结

致 谢

照 片

文献综述一中国专利文献有关超声造影剂制备和应用的发明专利

文献综述二纳米级微泡：一种新的超声造影剂

攻读博士期间课题研究、专利申请、论文发表及获奖情况