CCL21/CCR7轴对肺腺癌A549细胞增殖、迁移、侵袭及淋巴结转移的影响研究

摘要

背景与目的： 近年来，肺癌的发病率呈逐年上升的态势。非小细胞肺癌(non-small cell lungcancer，NSCLC)占肺癌所有病例的80％以上。由于常发生远处转移，肺癌患者的5年生存率只有15％左右。淋巴结转移是决定肺癌患者预后的主要因素。随着医学分子生物学理论和技术的发展，针对肺癌转移机制的靶向分子生物学研究取得了较大的进展，但引导肺癌细胞定向迁移的确切机制仍有待研究。CCR7是CC类趋化因子受体的成员之一，其配体CCL21特异的高表达于淋巴结的高内皮静脉(high endothelialvenules，HEV)及淋巴管内皮中。CCL21/CCR7在免疫和炎症反应的淋巴细胞定向迁移中发挥关键作用。最近的研究发现CCL21/CCR7在肿瘤转移中的作用令人瞩目，研究证实CCL21/CCR7在黑色素瘤、乳腺癌、胃癌、食管癌、肝细胞癌、结直肠癌、甲状腺癌、子宫颈癌和慢性淋巴细胞白血病的淋巴结转移中发挥重要作用。已有研究者在NSCLC组织中检测到CCR7 mRNA的表达，但其是否参与了肺癌淋巴结转移的过程还不得而知。为此本研究拟应用免疫组化检测肺癌组织中CCR7及血管内皮生长因子-C(Vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C)蛋白的表达，并分析其与NSCLC临床病理参数的关系，然后构建表达CCR7的质粒载体，并稳定转染．A549细胞，进而检测CCL21/CCR7轴对A549细胞增殖、钙内流、迁移、侵袭、转移相关因子表达及体内淋巴结转移的影响。探讨CCL21/CCR-7在肺癌淋巴结转移中的作用与机制，为探索肺癌新的治疗方法提供理论和实验依据。 方法： 1．收集65例NSCLC患者手术切除组织存档蜡块。免疫组化法分别检测肺癌组织中CCR7和VEGF-C蛋白的表达，分析其与肺癌临床病理参数的关系，并进一步探讨CCR7联合VEGF-C检测在诊断NSCLC淋巴结转移中的价值。 2．设计和构建能表达CCR7 cDNA的质粒载体(pEGFP-CCR7)，并以不表达任何基因的pEGFP-N1质粒为阴性对照，分别通过脂质体介导转染至A549细胞，经G418筛选(800 μg/mL)并稳定传代后，采用WST-1、软琼脂集落形成实验、激光扫描共聚焦显微镜(laser scanningconfocal microscope，LSCM)和Boyden小室模型，检测CCL21对A549-CCR7细胞和A549-pEGFP细胞体外增殖、钙内流、迁移和侵袭的影响；然后应用Real-Time RT-PCR和Western blot检测CCL21对A549-CCR7细胞和A549-pEGFP细胞转移相关因子表达的影响。 3．将A549-CCR7细胞和A549-pEGFP细胞等比例混合，并种植裸鼠爪垫皮下，一周后Real-Time RT-PCR检测各级淋巴结中CCR7相对于原位肿瘤组织的表达量，比较A549-CCR7细胞和A549-pEGFP细胞较早淋巴结转移能力。采用裸鼠爪垫皮下种植淋巴结转移模型，比较A549-CCR7细胞和A549-pEGFP细胞经淋巴道晚期发生淋巴结转移的能力，以及对荷瘤裸鼠生存期的影响。 结果：1．CCR7和VEGF-C蛋白在NSCLC组织中均有较高表达，分别达56.9％和 60％。CCR7和VEGF．C蛋白在NSCLC中的表达呈正相关(P<0.01)，而且两者的表达水平均随肺癌组织TNM分期升高及伴有淋巴结转移的发生而逐渐增强(P<0.01)。联合检测CCR7和VEGF-C在诊断NSCLC淋巴结转移中的准确度是比较高的，ROC曲线下面积达0.782。 2．培养基中无CCL21存在的情况下A549-CCR7细胞和A549-pEGFP细胞体外增殖、钙内流、迁移和侵袭能力均无显著差异(P>0.05)；在CCL21作用下，与A549-pEGFP细胞相比A549-CCR7细胞的体外增殖、钙内流、迁移和侵袭能力均显著增强(P<0.01)。这提示CCL21/CCR7轴能够增强A549细胞的体外增殖、钙内流、迁移和侵袭能力。在不表达CCR7的情况下，有无CCL21对A549细胞VEGF-C、MMPs和TIMPs的表达均无明显影响(P>0.05)；而在表达CCR7的情况下，CCL21能够显著增强A549细胞VEGF-C、MMP-2、9、11的表达(P<0.01或0.05)，显著降低TIMP-1，2的表达(P<0.01或0.05)，但对MMP-1的表达无明显影响(P>0.05)。 3．胭窝、髂动脉旁以及肾门淋巴结中A549-CCR7细胞的比例均显著高于原位肿瘤组织(P<0.01)，而且随着淋巴结的级数增高，A549-CCR7细胞所占比例有增高的趋势。与A549-pEGFP细胞相比，A549-CCR7细胞的荷瘤裸鼠生存期显著缩短(P<0.01)，淋巴结转移率显著提高(P<0.01)。提示CCL21/CCR7轴能够显著增强A549细胞经淋巴道发生淋巴结转移的能力。 结论： 1．CCR7可作为诊断NSCLC淋巴结转移的新型标志物，其与VEGF-C联合检测有助于NSCLC淋巴结转移的早期诊断和确定手术时的切除范围。 2．CCL21/CCR7轴促进A549细胞的体外增殖、钙内流、迁移和侵袭。 3．CCL21/CCR7轴促进VEGF-C、MMP-2、9、11的表达，抑制TIMP-1，2的表达，其促进NSCLC淋巴结转移可能与其调控VEGF-C，MMPs及TIMPs的表达有关。 4．CCL21/CCR7轴能够增强A549细胞裸鼠移植瘤经淋巴道发生淋巴结转移的能力。

目录

论文说明:英文缩写一览表

声明

摘要

前 言

第一部分CCR7和VEGF-C表达与非小细胞肺癌淋巴结转移的关系

前 言

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第二部分CCL21/CCR7轴对肺腺癌A549细胞的影响研究

前 言

分题一CCR7 cDNA片段克隆载体的构建及表达研究

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

分题二CCL21/CCR7轴对A549细胞增殖、钙内流、迁移和侵袭的影响研究

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

分题三CCL21/CCR7轴对A549细胞转移相关因子表达的影响研究

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第三部分CCL21/CCR7轴对A549细胞裸鼠移植瘤淋巴结转移的影响研究

前 言

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

全文结论

致 谢

图 片

参考文献

文献综述：趋化因子及其受体与肿瘤的关系

攻读学位期间文章发表情况