肾血管内皮损伤在造影剂肾病发生中的作用及机制研究

摘要

造影剂肾病(contrast media-induced nephropathy，CMN)是医院获得性肾功能衰竭的主要原因之一。在心血管介入诊疗过程中，常需要使用大剂量造影剂，而接受诊疗的患者多存在高胆固醇血症、高血压、糖尿病肾病、肾功能不全和高龄等危险因素，因而也更易诱发CMN，由此不仅显著影响患者病情恢复还会增加患者的死亡率。所以，如果能有效防治CMN将为心血管介入诊疗的安全实施提供有力保障。但截止目前，造影剂引发肾损害的机制尚未完全阐明，尤其是相关的基础研究较少。若能在分子水平或细胞水平上进一步揭示CMN的发病机理，并以此为基础寻找有效防治措施将具有非常重要的临床意义。 既往研究表明，CMN的发生可能主要与两个环节有关：一是造影剂的直接毒性作用；二是造影剂导致肾血流动力学改变引起的肾小管缺血、缺氧，同时两者之间可能又相互作用，促进CMN的发生、发展。由于CMN具有急性肾功能改变的特性，很多学者将研究重点放在了造影剂对肾小管功能的影响以及对小管上皮细胞的直接损伤作用上。但是，理论上讲，造影剂对肾血管内皮的影响在CMN的发病过程中可能也占有重要地位。这是因为：首先，肾血管内皮与造影剂是直接接触的，造影剂的毒性作用应该能直接损伤肾血管内皮，甚至导致肾血管内皮细胞凋亡和坏死；其次，许多研究结果证实，血管造影后一般会出现肾血管收缩，严重的血管收缩则会造成肾小管缺血性损伤，而肾血管收缩肯定与血管内皮细胞的功能改变密切相关。所以，造影剂对肾血管内皮的影响不容忽视，若以此为切入点，对造影剂肾血管内皮损伤效应及机制进行深入研究，以揭示肾血管内皮功能和细胞生物学活性改变在CMN发病过程中的作用，将会进一步阐明CMN的发病机理，并为寻找有效的防治措施提供重要理论基础。 为此，本研究以大鼠肾动脉和体外培养的肾小球内皮细胞为实验对象，以目前临床常用的造影剂为影响因素，运用生化检测、放免分析、蛋白印迹、逆转录PCR、荧光染色等多种技术，分以下三个部分对造影剂的肾血管内皮损伤效应及机制进行了研究： (1)首先观察不同类型和剂量的造影剂对肾动脉血管内皮功能的影响和损伤情况； (2)分析造影剂抑制。肾小球内皮细胞生长的剂量和时间依赖效应，从多方位观察并明确造影剂诱导肾小球内皮细胞凋亡的作用； (3)从氧化应激、钙稳态失衡、线粒体损伤等角度出发，对造影剂诱导肾小球内皮细胞凋亡的机制进行了初步探讨。 主要研究结果及结论如下： 一、在体外，无论是高渗还是低渗造影剂都可以在短时间内影响肾动脉血管内皮功能，导致内皮素-1(endothelin-1，ET-1)分泌增加，且呈剂量依赖性，但对一氧化氮(nitric oxide，NO)的分泌没有明显影响。ET-1分泌增加会导致NO／ET-1比例失调，引发肾动脉血管的收缩效应。不同的是，与对照组相比，30μl/ml的离子型高渗造影剂泛影葡胺即可造成肾动脉ET-1分泌的显著改变，而60μl/ml的非离子型低渗造影剂碘佛醇才会引起ET-1分泌增加，并且泛影葡胺各剂量亚组的ET-1值明显高于碘佛醇组，这说明高渗造影剂对肾血管内皮功能的影响比低渗造影剂显著。 二、90μl/ml的泛影葡胺作用4h后会导致大鼠肾动脉血管内皮乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，LDH)释放显著增加，而碘佛醇各组LDH释放虽逐渐增加，但与对照组相比都没有显著性差异。值得注意的是，90μl/ml的泛影葡胺组与90μl/ml的碘佛醇组LDH测定值也具有显著性差异，这表明高渗造影剂对肾动脉血管内皮细胞的损伤也要比低渗造影剂严重，且大剂量高渗造影剂的作用尤为显著。 三、正常大鼠与动脉粥样硬化大鼠肾动脉血管内皮在含90μl/ml碘佛醇的培养液中孵育1h后，两者NO分泌都没有明显变化，而ET-1分泌却明显增加，但动脉粥样硬化组ET-1增加的幅度与正常组相比并无显著性差异：若孵育4h，正常大鼠和动脉粥样硬化大鼠组LDH分泌均增加，但只有后者与自身对照组有显著性差异，提示造影剂对动脉粥样硬化肾血管内皮的损伤更严重。 四、碘佛醇和相同渗透压的甘露醇都可以降低肾小球内皮细胞存活率，但碘佛醇的作用更明显；碘佛醇作用24h后，肾小球内皮细胞LDH分泌显著增加，而甘露醇引起的LDH分泌增加没有统计学意义。提示造影剂对肾小球内皮细胞存活率的影响和损伤不仅仅与高渗透压有关，可能还有其它机制参与。 五、碘佛醇可以导致肾小球内皮细胞存活率下降，并呈明显的剂量和时间依赖性。90μl/ml碘佛醇作用24h后，细胞形态学观察、DNA琼脂糖凝胶电泳和Hoechst33342/PI荧光染色等均证实部分肾小球内皮细胞发生凋亡。这说明即使是副作用较小的非离子型低渗造影剂也可以抑制肾小球内皮细胞生长，诱导细胞凋亡。而肾小球内皮细胞凋亡则会进一步影响肾小球毛细血管内皮功能，这可能是肾血流动力学改变及肾小管缺血、缺氧的原因之一。 六、RT-PCR结果显示，碘佛醇作用24h后，肾小球内皮细胞抑凋亡基因Bcl-2 mRNA表达下降，而促凋亡基因Bax mRNA表达上升；随着碘佛醇浓度的增加，caspase-3活化片段蛋白表达逐渐增强；Annexin/PI荧光染色发现，与正常对照组比，碘佛醇组Annexin/PI阳性染色细胞及细胞凋亡率均明显增加；若预先应用caspase-3特异性阻断剂孵育肾小球内皮细胞，则可以有效抑制细胞凋亡。这进一步证实造影剂可以诱导肾小球内皮细胞凋亡，且caspase-3活化可能在其中发挥了重要作用。 七、90μl/ml碘佛醇作用24h后肾小球内皮细胞平均钙荧光强度明显增强，且分布不均一，提示碘佛醇引起了肾小球内皮细胞Ca<'2+>超载和Ca<'2+>的空间分布改变；正常状态下肾小球内皮细胞中只有极低水平的Cyt c表达，而碘佛醇作用后肾小球内皮细胞中Cyt c的蛋白表达水平显著升高；但碘佛醇对肾小球内皮细胞谷胱甘肽过氧化物酶(Gluathione peroxidase，GSH-PX)活力没有明显影响。提示造影剂诱导的肾小球内皮细胞凋亡可能主要与钙稳态失衡和线粒体损伤机制有关。 综上所述，我们的研究表明，造影剂可以显著影响肾血管内皮功能；即使是副作用较小的非离子型低渗造影剂在一定剂量时也能明显抑制肾小球内皮细胞存活率，甚至诱导细胞凋亡；造影剂诱导的肾小球内皮细胞凋亡可能主要与钙稳态失衡和线粒体损伤机制有关。通过本研究，不仅从肾血管内皮损伤和功能变化的角度进一步揭示了CMN的发病机理，同时也为临床合理应用造影剂及预防CMN提供了可靠的理论依据。

目录

论文说明：英文缩写一览表

声明

摘要

前 言

第一部分造影剂对大鼠肾血管内皮的损伤效应

材料与方法

实验结果

讨 论

小 结

第二部分造影剂诱导肾小球内皮细胞凋亡的作用

材料与方法

实验结果

讨 论

小 结

第三部分造影剂诱导肾小球内皮细胞凋亡的机制研究

材料与方法

实验结果

讨论

小 结

全文总结

致 谢

参考文献

文献综述一：造影剂肾病的研究进展

文献综述二：动脉粥样硬化与肾损害

在读博士期间发表的文章