模拟微重力生物反应器制备组织工程骨的实验研究

摘要

研究背景及研究目的： 各种原因所致的骨缺损在临床上十分常见，其治疗的关键在于获取足量成骨活性好的骨修复材料。组织工程技术能够在体外制备生物活性良好的骨修复材料，但组织工程骨广泛应用于临床尚需解决一系列技术和工艺问题，包括：种子细胞体外规模化扩增方法、扩增后生物安全性评估、种子细胞与支架材料高效均匀接种、大体积组织工程骨中心供养、如何降低组织工程骨中异种血清残留量、组织工程骨的最佳体外培养时间和方式等。 生物反应器的合理应用有望解决上述产业化问题，其中旋转壁式生物反应器(Rotating Wall Vessel Bioreactor，RWVB)具有剪切力小、传质作用好等优点，绕水平轴旋转的RWVB在一定条件下还具备模拟微重力环境的特性。模拟微重力环境可使细胞、组织培养摆脱重力的影响，实现更接近体内生存环境的三维培养，可能更有利于细胞体外增殖和组织成熟。 本课题采用一种新型的RWVB——旋转细胞培养系统(Rotary Cell CultureSystem，RCCS)在体外模拟微重力环境，并将其应用到组织工程产品制备的种子细胞体外规模化扩增、组织工程骨的动态构建和体外培养成熟三个方面，以观察模拟微重力生物反应器对种子细胞生物学特性、组织工程骨构建效率及体外培养成熟的影响，并探索采用自体血清与牛血清序贯应用策略以降低组织工程骨中异种血清残留量的可行性，为探索高质量组织工程骨的规模化制备方法奠定基础。 实验方法： 1、采用密度梯度离心与贴壁培养相结合的方法分离健康志愿者红骨髓、培养原代hMSCs，并对获取的hMSCs进行表面标记物和多向分化潜能鉴定。 2、以全程自体血清培养和牛血清培养作为对照，检测自体血清对牛血清适应性hMSCs的增殖和成骨分化影响。 3、采用RCCS模拟微重力培养环境，并结合Cytodex-3微载体培养hMSCs，通过形态学观察、细胞计数、MTT及CCK-8法观察hMSCs的生长情况，检测培养液中LDH活性及葡萄糖和乳酸浓度；并检测该培养方式对hMSCs成骨诱导分化的影响。 4、观察RCCS模拟微重力培养环境微载体法连续传代培养hMSCs的增殖状况和β-半乳糖苷酶染色检测细胞老化状况，体外连续培养4代后检测细胞的致瘤性。 5、采用hMSCs与DBM支架材料构建组织工程骨，比较RCCS模拟微重力培养环境中动态接种法与常规静置接种和纤维蛋白凝胶双相接种法构建组织工程骨的细胞接种效率和上架细胞密度。 6、观察RCCS模拟微重力培养和常规静置培养分别对组织工程骨中种子细胞的增殖和成骨分化的影响。 7、采用裸鼠皮下异位成骨模型检测不同构建方法和不同体外培养时间的组织工程骨体内成骨活性。 实验结果： 1、原代hMSCs接种后4d，可观察到成纤维细胞样的细胞集落，9至12d长满单层培养瓶底，传代细胞4至7d长满单层；表达CDl05而不表达CD415；可诱导成软骨分化；成骨诱导后碱性磷酸酶染色阳性，Ⅰ型胶原和骨钙素免疫组化阳性，可形成矿化结节。 2、牛血清后序贯使用自体血清培养hMSCs，其增殖和成骨诱导分化无显著改变。 3、在RCCS模拟微重力培养环境中，hMSCs能在Cytodex-3微载体表面附着生长，第9d细胞数量达到峰值；细胞计数、MTT法、CCK-8法检测结果提示：平皿培养hMSCs对数生长期为第2-5d，细胞数量第6d达峰值时增长到3.78倍；微重力培养法hMSCs对数生长期为第2-8d，第9d达到细胞峰密度时细胞数量增殖11.9倍，单位培养液中细胞密度较平皿组增加15.8倍，葡萄糖消耗程度及LDH和乳酸浓度显著比平皿组低。 4、微重力组与平皿组hMSCs经成骨定向诱导培养12d，单位细胞ALP活性均达到峰值，二者无显著差异；两种培养方法获得的细胞碱性磷酸酶染色均为阳性，Ⅰ型胶原和骨钙素免疫组化阳性，体外培养都可形成钙结节，成骨诱导后hMSCs的增殖速度减慢。 5、通过直接加入空白微载体的方法可实现RCCS微载体法培养hMSCs传代培养，传代细胞增殖速度略减慢，连续RCCS传4代后hMSCs呈现阳性β-半乳糖苷酶阳性染色；连续传四代(RCCS培养57d，体外培养累计72d)获得的hMSCs染色体核型正常、软琼脂克隆形成试验阴性、裸鼠致瘤实验阴性。 6、RCCS动态接种在1×10<'6>细胞/块及更高密度组比静置接种法效率高，但该方法的接种效率和组织块所含细胞密度均比FG双相接种法接种效率低。 7、RCCS动态培养法获得的组织块较常规静置培养法获得更高的细胞密度峰值，组织学观察有更多细胞外基质成分。双相接种法以1×10<'6>细胞/块密度接种获得的组织工程骨在RCCS中动态培养12d可达到最大细胞密度。 8、在裸鼠皮下异位成骨模型中，X线摄片、组织学观察、免疫组化染色证实：双相法高密度接种后经过RCCS体外培养12d的组织工程骨比含相同数量种子细胞的或静置法培养相同时间的组织工程骨都具有更好的成骨活性，以上3组材料均比单纯DBM具有更好的体内成骨效应。 结论： 1．采用密度梯度离心和贴壁培养法分离人红骨髓获得的细胞在形态、表面标志、多向分化能力方面都符合hMSCs的特征，第2代hMSCs具有较高的纯度和相当的数量，是骨组织工程较理想的种子细胞；自体血清对牛血清适应性的hMSCs体外增殖和成骨诱导分化无不利影响。 2．采用微载体法在RCCS模拟微重力环境中培养hMSCs能实现细胞三维培养、提高细胞培养密度、提高培养液利用率、促进细胞快速增殖、实现(无酶消化)连续传代、不影响成骨诱导分化、体外连续传4代(共57d)仍无致瘤性，故该方法适合。hMSCs体外规模化扩增。 3．纤维蛋白胶双相接种法与静置接种法和RCCS模拟微重力动态接种法相比，显著提高种子细胞与支架材料复合效率和组织工程骨中的种子细胞密度，可实现组织工程骨的快速高效构建。 4．RCCS模拟微重力环境能促进种子细胞的物质交换、提高组织工程骨中的种子细胞密度、促进种子细胞分泌细胞外基质，采用该方法培养的组织工程骨具有较传统静置培养法和即刻构建法获得的组织工程骨具有更好的成骨活性。

目录

论文说明：英文缩写一览表

声明

摘要

前 言

第一部分人间充质干细胞生物学特性观察及血清对其的影响

引 言

材料与方法

结 果

讨论

小 结

第一部分实验图片

参考文献

第二部分模拟微重力生物反应器规模化培养人间充质干细胞的实验观察

引 言

材料与方法

结 果

讨论

小 结

第二部分实验图片

参考文献

第三部分模拟微重力生物反应器制备组织工程骨及其成骨效能观察

引 言

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第三部分实验图片

参考文献

全文结论

致 谢

文献综述一：间充质干细胞在组织工程中的研究进展

文献综述二：旋转壁式生物反应器在骨组织工程中的应用进展

攻读学位期间发表论文与申请的专利