大鼠粘蛋白rMuc3酶切保守基序对其蛋白酶切的影响的研究

摘要

目的：通过定点突变技术得到保守基序的各种突变体(p20l/a、p20s1/a、p20k/a、p20i/a、p20v1/a、p20v2/a)，并通过Westernblotting探讨保守基序中各氨基酸对大鼠粘蛋白rMuc3蛋白酶切的影响。 方法： 1、采用定点突变技术，设计相应突变引物，以p20为模板，基于。PCR扩增得到突变体，并经测序验证。 2、用质粒中量提取试剂盒得到足量的质粒，然后利用阳离子脂质体LipofectAMINE将各突变体及p20转染入COS-7细胞中。 3、通过Westernblotting检测各突变体的表达，采用Quantityone分析各种突变体未酶切和酶切部分的表达强度，并分析未酶切部分所占比例。 结果： 1、使用PCR定点突变的方法，获得突变体，经序列测定后利用clustalx1.83软件与模板p20比对，证实突变完全成功。并通过质粒中量提取获得了足量的质粒用于转染。 2、裂解细胞后将细胞裂解物进行Westernblotting免疫印迹实验，证实在55kDa处存在未酶切的部分，在30kDa处存在可被抗V5抗体检测的N端部分，经过Quantityone分析后发现，S2/A完全抑制了酶切的发生，G/A抑制了绝大部分的酶切(未酶切部分占79％)，L/A、I/A、V1/A、V2/A均对酶切产生了不同程度的抑制，未酶切部分分别为22％、39％、14％和17％，而：K/A和S1/A几乎对酶切没有影响，其未酶切部分分别为6％和3％，酶切效率与p20(未酶切部分占4％)几乎一样。 结论：以p20为模板的各种突变体突变成功，以脂质体转染法将所有突变体导入COS-7细胞并获得了相应突变体的高效表达。通过Westernblotting免疫印迹实验结果揭示了酶切保守基序LS1KGS2IV1V2中各氨基酸对其蛋白酶切的发生是很重要的，其机理可能是因为此保守基序位于β2和β3片层之间的环状区，其上的氨基酸对于维持粘蛋白的构象是必须的。在S1上可能有O型糖链的存在，并且去除此O型糖链不影响酶切保守基序LS1KGS2IV1V2的酶切。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写词表

声明

第一部分 L/A、S1/A、K/A、G/A、S2/A、I/A、V1/A、V2/A表达载体的构建

材料和方法

结 果

讨 论

第二部分 rMuc3羧基端酶切保守基序内各氨基酸对其蛋白酶切的影响

材料与方法

结 果

讨 论

全文总结

致 谢

参考文献

文献综述 蛋白质结构域SEA组件的结构和功能

攻读硕士学位期间撰写论文情况