（1，3）-β-D-葡聚糖检测与巢式PCR扩增在播散性毛孢子菌病辅助诊断中的意义

摘要

研究背景和目的： 继2000年我国首例播散性毛孢子菌病病例报道以来，播散性毛孢子菌病愈来愈受到广泛重视。该病是一种广泛累及皮肤、肝、脾、肺、肾等器官的系统性真菌病，主要致病菌为阿萨希毛孢子菌。患者多因病情复杂、多器官受累、诊断不明和(或)治疗不及时而死亡。由于该病的临床表现缺乏特异性，其诊断在很大程度上要依靠准确、特异的辅助检查。传统辅助手段包括病原菌培养、鉴定及组织病理检查等，耗时长，至少需1周以上时间，不仅影响该病的早期诊断和及时治疗，也因为临床上缺乏特异、快速的检诊手段及对该病的认识不足而易造成误诊误治。 目前，非培养诊断技术如真菌成份及代谢产物测定、特异性DNA片段扩增等以其灵敏、快速等优点而日益受到关注。真菌的结构由细胞壁、隔膜、细胞膜及有关细胞器构成，这些结构的组成成份及其代谢产物在真菌的生成和繁殖过程中，含量及活性也会有相应的变化。(1，3)-β-D-葡聚糖是真菌胞壁的重要组成成分之一，仅在深部真菌感染后经吞噬细胞吞噬后该成分释放入血，而在浅部真菌感染时并不释放，因此对播散性真菌感染的诊断有重要价值。分子生物学方法因其具有较高的敏感度和特异度，近来在深部真菌感染早期诊断中也倍受关注。常用的基本的方法包括核酸杂交及扩增技术和巢式PCR等技术等。 本研究在建立播散性阿萨希毛孢子菌(Trichosporonasahii,T.asahii)感染模型的基础上，分别对比观察了肺泡灌洗液、尿液及血浆的(1，3)-β-D-葡聚糖的含量，同时采用巢式PCR方法检测三种体液标本中T.asahiiDNA片段，并与真菌培养方法进行比较，试图从血液之外的其它一些体液中获得新的、具有诊断意义的标本，同时进一步评价(1，3)-β-D-葡聚糖检测和巢式PCR方法在播散性T.asahii病早期诊断、预后判断方面的意义，为研究T.asahii珀勺致病机理、病程进展及治疗前景提供重要依据。 方法和结果： 1.建立阿萨希毛孢子菌感染动物模型Wistar雄性大白鼠45只，随机分为三组实验A组、实验B组和对照组(C组)，每组15只。实验开始第0天，实验A组和B组大鼠分别尾静脉接种12×107CFU/ml浓度T.asahii孢子悬液0.8ml，对照组尾静脉注射等量生理盐水。实验A组在接种第10天后处死，实验B组及对照C组在接种第20天后处死。分别采集三组动物的肺泡灌洗液、尿液及血浆，一部分作真菌培养，另一部分采用G试验检测三种标本中(1，3)-β-D-葡聚糖含量，用巢式PCR检测体液标本中T.asahii特异性DNA片段。同时采集每只动物模型的肝、肺、肾组织，一部分经10％甲醛固定、包埋、切片、HE、GMS和PAS染色制片，另一部分制成匀浆送培养。 2.真菌培养结果组织培养阳性率为2％，血浆真菌培养阳性率为3.33％，支气管肺泡灌洗液及尿液真菌培养均为阴性。 3.(1，3)-β-D-葡聚糖检测结果感染动物模型血浆、支气管肺泡灌洗液、尿液标本G试验平均敏感性分别为76.67％、80.00％、和10％，其中血浆、支气管肺泡灌洗液标本G试验结果与对照组有显著差异(P＜0.001)，尿液标本测试结果无统计学意义；组织培养阳性数较多的动物其血浆标本(1，3)-β-D-葡聚糖浓度较其它标本高，即(1，3)-β-D-葡聚糖浓度与组织脏器感染数量之间存在正相关，二者存在线性关系，为高度相关(I rI＞0.7，P≤0.05)；感染10d时三种标本(1，3)-β-D-葡聚糖平均浓度到达峰值，血浆为54.565pg/ml，支气管肺泡灌洗液为24.508pg/ml，尿液13.117pg/ml，浓度与感染时间成正比。20d后各标本(1，3)-β-D-葡聚糖浓度下降，血浆为27.077pg/ml；支气管肺泡灌洗液浓度为21.339pg/ml；尿液为11.748pg/ml，此时浓度与感染时间成反比。 4.巢式PCR方法检测结果30只实验动物血浆标本巢式PCR平均敏感性为66.67％，支气管肺泡灌洗液标本平均阳性率为43.33％，尿液标本为20.00％。其中血浆、支气管肺泡灌洗液标本敏感性与对照组比较有显著差异(P＜0.001)，尿液标本检测结果与对照组相比提示有差异(0.001＜P＜0.05)。血浆、支气管肺泡灌洗液巢式PCR方法的阳性率与血培养和灌洗液培养结果比较经配对卡方检验，有显著统计学差异(P＜0.005)。5.G试验结果与巢式PCR方法和真菌培养法结果的对比30只实验动物血浆标本巢式PCR平均阳性率为66.67％、G试验为76.67％、真菌培养为3.33％，其中G试验阳性率与血培养结果经配对卡方检验，二者之间存在显著差异(X=21.04，P=0.0000且b＞c)，巢式PCR方法的阳性率与血培养比亦有显著统计学差异(X1=17.05，P1=0.0005且b＞c)；血浆G试验阳性率虽然略高于巢式PCR方法，但两者无统计学差异(P＞0.05)。支气管肺泡灌洗液培养全部为阴性；支气管肺泡灌洗液标本巢式PCR方法平均阳性率为43.33％，G试验为80.00％，巢式PCR方法和G试验结果均与灌洗液真菌培养有显著差异(P＜0.005)，同时两种检测方法者之间的阳性率也存在统计学差异(X2=9.60，P2=0.0019)。 结论： 1.与真菌培养相比，G试验和巢式PCR均具有较高敏感性：对照组三种体液标本G试验检测均为阴性，提示该试验假阳性率低、特异性较高。与血培养方法相比(1，3)-β-D-葡聚糖检测具有阳性率高、采血量少(0.5-1ml)等优点，因而更容易被患者接受。本实验首次对支气管肺泡灌洗液和尿液标本中的(1，3)-β-D-葡聚糖进行了观察，结果发现支气管肺泡灌洗液标本G试验平均敏感性为80％，较其它标本略高。分析原因，一方面肺部是T.asahii的易感部位，另一方面肺泡中存在的大量吞噬细胞，吞噬病原菌后可能释放更多的(1，3)-β-D-葡聚糖，这一特性为该疾病的临床诊断提供了一条新的途经。尿液标本中G试验敏感性较低，仅为10.00％，且多见于感染脏器数量较多的动物，所以在尿液中检测到(1，3)-β-D-葡聚糖，提示感染可能较为严重和广泛。巢式PCR方法亦在血浆、支气管灌洗液和尿液标本的检测中有良好表现，检测结果显示实验A、B两组血浆、支气管肺泡灌洗液标本的巢式PCR结果与对照组相比均有显著差异，这些数据说明巢式PCR方法在检测播散性T.asahii感染方面具有较高的敏感性和特异性。实验中血浆标本巢式PCR方法的敏感性显得尤为突出，更具有临床应用价值 2.G试验和巢式PCR方法各有特点：虽然G试验和巢式PCR扩增均有较高的敏感性和特异性，但二者各有其特点。巢式PCR扩增适合于播散性毛孢子菌病菌血症，而在没有菌血症形成的情况下，G试验则仍具有检测意义。因为G试验并非如巢式PCR法一样以菌体DNA片段为目标，而是检测真菌被吞噬后所释放的(1，3)-β-D-葡聚糖成分。实验动物静脉接种菌液后短期内形成菌血症，此时标本经巢式PCR检测，阳性率很高；一段时间后，大部分菌体被血液中的白细胞吞噬、代谢，血液中完整的真菌菌体逐渐变少甚至消失，其DNA被分解破坏，使得血浆巢式PCR方法阳性率降低。而未被吞噬的真菌被循环血液带到各脏器并逐渐繁殖，再次经组织中的噬细胞所吞噬，(1，3)-β-D-葡聚糖成份释放入血，恰好被G试验所检测到，使得该阶段血浆G试验的阳性率略高于巢式PCR，所以G试验的可应用时间更长。然而G试验只能提示深部真菌感染的存在，不能确定是否为毛孢子菌，而菌种的分类恰恰是巢式：PCR方法的优势所在。 3.(1，3)-β-D-葡聚糖检测有助于判断感染的范围：(1，3)-β-D-葡聚糖的浓度与组织脏器感染数量之间存在正相关，即(1，3)-β-D-葡聚糖浓度越高，组织器官感染的数量越多。经组织病理切片证实，(1，3)-β-D-葡聚糖浓度值越高的大鼠，病理组织切片上亦显示越多的微脓疡和组织破坏。值得一提的是，虽然组织培养总阳性率较低，但其中肾脏组织培养的阳性率相对较高，这一点与国外报道中肾脏中T.asahii毛孢子菌的清除率最低相吻合，因此对肾脏的观察应引起今后研究的重视。 4.(1，3)-β-D-葡聚糖检测有助于判断感染的转归：(1，3)-β-D-葡聚糖检测有助于判断感染的转归感染的不同时期(1，3)-β-D-葡聚糖浓度亦有相应的变化。接种初期在免疫抑制的条件下真菌大量繁殖，(1，3)-β-D-葡聚糖释放量急剧上升，10d后随着机体免疫力逐渐恢复，吞噬细胞对病原菌的吞噬能力逐渐增强，真菌在血液循环中的数量迅速减少，但由于感染组织中葡聚糖的释放在一定程度上弥补了血浆本身(1，3)-β-D-葡聚糖释放的减少，使得(1，3)-β-D-葡聚糖浓度呈缓慢下降的趋势。实验观察发现，真菌接种两周后，大鼠饮食、活动和反应能力显著好转，与(1，3)-β-D-葡聚糖浓度改变一致。所以，动态观察(1，3)-β-D-葡聚糖对判断感染的转归有一定的帮助。 本研究中(1，3)-β-D-葡聚糖测定及巢式PCR方法，虽然具备真菌培养、病理检查等传统辅助诊断方法所不具备的优点，但其检测结果仍需结合临床，进行综合分析。本研究虽然在动物实验中取得了初步成果，但仍需加强其可重复性及准确性，以便逐步完善，在实际临床中得以推广应用。

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文摘

英文文摘

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声明

前 言

第一部分播散性阿萨希毛孢子菌感染动物模型三种体液标本的(1，3)-β-D-葡聚糖检测

材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

第二部分三种体液标本的阿萨希毛孢子菌DNA特异性片段巢式PCR扩增

材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

全文总结

致 谢

文献综述一真菌组成成份及代谢产物检测在真菌病诊断中的应用进展

文献综述二真菌感染的诊断与治疗进展

攻读硕士学位期间发表的论文