复方奥硝唑甲磺酸培氟沙星缓释牙栓毒理学安全性试验研究

摘要

背景目的： 牙周病是一波及广、危害大的口腔感染性疾病，该疾病严重影响人们的咀嚼消化功能，导致牙齿脱落，还可以成为某些全身疾病的危险因素，所以牙周病一直是国内外学者关注的焦点。由于牙周病慢性、迁延的特点，加之耐药性的产生，目前治疗效果尚不理想，寻找新的药物和新的用药方法受到关注。前期我们针对牙周病的病因及病理特点，筛选以复方奥硝唑甲磺酸培氟沙星合理配伍，在体外抑菌实验研究上取得了满意效果；并依牙周生理外形特点，采用新的缓释材料，设计出适用于不同牙位、不同深度、符合前后牙周袋形态的牙栓，克服了液体制剂易流失，凝胶制剂易污染，固体制剂需修剪等缺点。 为了进一步的开发应用，本研究对该缓释牙栓进行了系列动物毒理学试验研究；牙栓在牙周袋中抑菌消炎的同时必然也会作用于牙周组织，而人牙周膜成纤维细胞(HPDLF)是牙周组织的主要功能细胞，在创伤修复和组织再生中发挥着重要作用，进行相关分析探讨缓释牙栓对HPDLF的生物学活性的影响，为进一步动物、临床试验提供试验依据。 方法： 1．采用冷压法自制复方奥硝唑甲磺酸培氟沙星缓释牙栓，自然凉干，紫外照射30min，消毒备用，每枚重10mg，含原药量1mg。 2．以1 L蒸馏水缓释牙栓的最大浓度剂量即210 g/L，制成混悬液，按0.4ml/10g最大允许容积一次给予昆明小鼠灌胃，连续观察14 d，观察小鼠接受过量受试药物所产生的急性中毒反应，为多次反复给药的毒性试验设计剂量、分析人体过量时可能出现的毒性反应。 3．将40只SD雌雄大鼠，平均分到4个组中；①小剂量组：按每日5g/kg给药；②中剂量组：按每日10g/kg给药；③大剂量组：按每日20g/kg给药；④空白对照组：按等容量的生理盐水灌胃。观察动物反复给予受试药物后，对机体产生的毒性反应及其严重程度，主要的毒性靶器官及其损害的可逆性，提供无毒性反应剂量及临床上主要的监测指标，为制定人用剂量提供参考。 4. 40只豚鼠平均分为4组进行皮肤过敏试验：①空白对照组：②缓释牙栓组(210g/L)；③辅料基质组；④阳性对照组。试验前24 h在豚鼠背部两侧，剪出3cm×3cm的去毛区，观察缓释牙栓对皮肤的影响。 5.将20只SD大鼠下唇缝成一盲袋，然后随机分为2组，分别用缓释牙栓(210g/L)及等体积基质注入袋内，了解药物对牙周粘膜毒性及刺激的影响。 6.选择经2％荧光素钠溶液检查证实，无角膜损伤的健康新西兰兔6只，将缓释牙栓(210g/L)滴入右眼结膜囊内，观察药物对眼部刺激的影响。 7.利用免疫组化ABC法对原代培养的HPDLF，进行波形丝蛋白和角蛋白单克隆抗体染色，作细胞来源鉴定。 8.取生长良好的第5代HPDLF，制备成浓度为4×10<'7>/L细胞悬液，每孔加入浓度分别为0、0.1、0.5、2.5、10、50、200 g/L经DMEM缓释的牙栓，单纯加培养液作空白对照，于不同时间用酶标仪检测各个浓度缓释牙栓OD值，评定药物对细胞增殖的影响。 9.取在标准环境下培养24 h的96孔培养板HPDLF，加入浓度分别为O、0.1、0.5、2.5、10、50、200 g/L经DMEM缓释的牙栓，每孔加入1 μCi<'3>H-TdR，在液闪记数仪上测量每分钟闪烁记数(cpm)，评定药物对HPDLF DNA合成的影响。 10.将加有不同浓度缓释牙栓的96孔板HPDLF，每孔加入100 μl 0.2％TritonX-100，考马斯亮兰染，在波长570处检测OD值，探讨缓释牙栓对HPDLF蛋白含量的影响。 结果： 1.经一次性给予最高浓度(210g/L)，及小鼠最大灌胃容量(0.4ml/10g)缓释牙栓后，小鼠无一中毒死亡，小鼠对缓释剂的MTD为8.4g/kg。按公斤体重计算，相当于50kg成人每日用量(假设32颗牙齿均用药，每颗牙放置10mg牙栓一枚)的1300倍以上。 2.缓释牙栓组与对照组大鼠，在60 d试验期内均活动正常、行为活泼、毛发光泽，无一死亡；体重增长基本一致；血常规、肝。肾功检验未见显著性差异；5个脏器的比重量与对照组相比无统计学差异；经病理切片镜下检查，心肌纤维横纹清晰，细胞分化好；肝小叶结构清晰，肝细胞分化良好；未见肾小管变性坏死，间质无出血或炎症；脾无水肿；肺无充血、水肿和炎症反应。 3.口腔粘膜完整，缓释牙栓组与基质组无差异，粘膜病理切片未见改变。 4.缓释牙栓组动物自给药72 h内未出现红斑及水肿，与空白对照组无差异；基质组无致敏现象；阳性对照组动物皮肤受试区自激发给药6 h后，有明显轻度红斑出现，无水肿，致敏率100％。 5．新西兰兔眼部刺激试验出现结膜充血，轻微水肿，少量分泌物，评分≤3分。在用药48 h后全部消失，为可逆变化，由于大多数人认为兔眼较人眼敏感，因此可以推测牙栓缓释剂对人眼基本无刺激性。 6．原代HPDLF呈长梭形，胞质均匀，核呈圆形或椭圆形，核仁清晰，免疫组化染色表明，波形丝蛋白染色阳性，角蛋白染色阴性。 7．经单因素方差分析的结果显示缓释牙栓在0.1、0.5、2.5、10、50、200 g/L时OD值与对照组相比没有显著性差异(P>0．05)。 8．缓释牙栓在0.1、0.5、2.5、10、50、200 g/L浓度时，与对照组比，蛋白质OD值、DNA合成均无显著性差异(P>0.05)。 结论： 1．自制复方奥硝唑甲磺酸培氟沙星缓释牙栓每一批次制备规范，粒差小，体外缓释稳定，符合2005年版《中国药典》对栓剂的规定。 2．急、慢性毒性试验结果表明缓释牙栓无明显毒性作用，大鼠的一般状态、行为活动、饮食、尿便、体重增长、血液学、血液生化学及主要脏器系数与对照组比较均未见明显差异，各脏器病理学检查均未见明显药物损害性病理改变，无局部刺激作用及过敏反应，不同动物对该缓释牙栓有很大的耐受性，提示该药的使用安全性高。 3．免疫组化染色表明，证明所培养的细胞为来自中胚层的成纤维细胞。 4．在200 g/L缓释浓度范围内，该缓释牙栓有较佳的生物相容性，未显示有HPDLF抑制作用。

目录

论文说明：英文缩写及中英文对照表

声明

摘要

前 言

第一部分复方奥硝唑甲磺酸培氟沙星缓释牙栓动物毒性实验研究

材料与方法

结 果

讨 论

第二部分人牙周膜成纤维细胞原代培养及鉴别

材料与方法

结 果

讨 论

第三部分复方奥硝唑甲磺酸培氟沙星缓释牙栓对人牙周膜成纤维细胞生长的影响

材料与方法

结 果

讨论

全文总结

致 谢

照 片

参考文献

文献综述牙周药物缓释系统研究进展

研究生期间发表文章