SCL转基因联合SCF促Cajal间质细胞恢复的在体实验研究

摘要

背景： Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal．ICC)是胃肠道的起搏细胞，具有产生、传播慢波的功能，参与调控肠神经信号传导。现已证明慢传输性便秘等众多胃肠动力紊乱性疾病都存在ICC数目减少。新近的研究提示ICC发生平滑肌细胞样表型转化(而非凋亡)可能是众多胃肠动力紊乱性疾病ICC减少的共同机制。 ICC细胞膜特异性表达酪氨酸激酶受体(c-kit)，与其配体干细胞因子(stem cellfactor，SCF)结合后所启动的SCF/c-kit信号通路，对ICC发育、分化及胃肠道节律性活动的稳定至关重要。干细胞白血病(stem cell leukemia，SCL)基因编码螺旋-环-螺旋类转录因子，是c-kit上游的重要调控基因，通过作用c-kit基因启动子调节c-kit表达来发挥其“生存基因”的功能，具有强烈的促c-kit表达作用。我们的前期研究发现，转SCL，基因可以在细胞以及组织培养条件下上调c-kit表达，联合SCF应用，恢复SCF/c-kit信号通路，促进ICC平滑肌细胞样表型逆转恢复。因此推测在体SCL转基因亦可通过上调c-kit表达，联合SCF应用，恢复SCF/c-kit信号通路，促进ICC平滑肌细胞样表型逆转恢复。为此，本研究构建表达SCL基因的重组腺病毒Ad-SCL，联合应用SCF，在体探讨SCL转基因联合SCF对Cajal间质细胞恢复的影响及机制。为今后深入探讨促ICC恢复及其机制奠定基础。 目的： 1．快速构建并鉴定含有人SCL，基因的重组腺病毒Ad-SCL； 2．细胞及在体水平观察重组腺病毒Ad-SCL，转染效率及生物安全性； 3．观察重组腺病毒Ad-SCL联合SCF应用对ICC恢复的作用。 方法： 1．采用亚克隆技术将人SCL基因片断定向克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上，获得重组质粒pAdTrack-CMV/SCL。Pme Ⅰ线性化后转化包含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183菌。同源重组后筛选阳性克隆，用脂质体介导转染293细胞，绿色荧光蛋白观察以及PCR鉴定获得的重组腺病毒Ad-SCL。 2．用不同MOI的重组腺病毒Ad-SCL转染Hela细胞株，确定最佳病毒转染MOI；用最佳MOI的重组腺病毒Ad-SCL转染Hela细胞株，用MTT细胞增殖实验观察对Hela细胞生长的影响；用RT-PCR法检测重组腺病毒Ad-SCL介导的SCLmRNA在Hela细胞以及体外培养的ICC中的表达；经ICC缺失模型Balb/c小鼠尾静脉注射1.6×10<'9>PFU的重组腺病毒Ad-SCL，在不同的时相点(2d、7d、15d、30d)检测重组腺病毒在小鼠心、肺、肝、脾、肾、小肠及大肠组织内的分布和表达；HE染色法观察重组腺病毒的体内毒性；RT-PCR法分析重组腺病毒介导的SCL mRNA在各脏器内的表达。 3．取ICC缺失模型Balb/c小鼠，经尾静脉注射1.6×10<'9> PFU的重组腺病毒Ad-SCL，Western Blot检测注射后2d、7d、15d、30d结肠肌条c-kit蛋白的表达；取ICC缺失模型Balb/c小鼠，经尾静脉注射1.6×10<'9>PFU的重组腺病毒Ad-SCL以及SCF(30μg/kg，连续腹腔注射5d)后7d、14d、21d、28d，免疫组化染色以及超微结构观察ICC在结肠的分布及数量的变化。 结果： 1．酶切法以及PCR法证实利用同源重组法成功地构建了含有人SCL基因的重组腺病毒载体，经脂质体转染试剂转染293细胞，获得重组腺病毒．Ad-SCL。病毒滴度测定可达1.6×10<'11>pfu/ml。 2．制备的重组腺病毒Ad-SCL对Hela细胞株以及体外培养的ICC具有很强的转染效率。当MOI为50时，对Hela细胞的转染效率为(90±1.825)％，当MOI为90时，对Hela细胞的转染效率为(98.5±1.290)％。MTT细胞增殖实验证实重组腺病毒Ad-SCL对Hela细胞生长没有影响。RT-PCR证实重组腺病毒Ad-SCL可以介导SCL基因在Hela细胞以及体外培养的Cajal间质细胞中表达。 3．重组腺病毒Ad-SCL在体应用时，在ICC缺失模型鼠体内有广泛的分布；2d时绿色荧光蛋白表达最明显，30d最弱；RT-PCR法证实在体应用重组腺病毒Ad-SCL后30d，在ICC缺失模型鼠结肠肌条内仍然可以检测到SCL mRNA的表达。 4．HE染色法显示在体应用重组腺病毒Ad-SCL后，ICC缺失模型鼠结肠等脏器无明显损伤表现。 5．Western blot检测显示，在体应用重组腺病毒Ad-SCL后，可以明显上调ICC缺失模型鼠结肠肌条的c-kit蛋白的表达，2d可检测到、7d最明显、15d下降、30d恢复正常水平。 6．免疫组化染色以及超微结构观察显示在重组腺病毒Ad-SCL和SCF联合应用后14d，ICC缺失模型鼠结肠内ICC．MP最先得到部分恢复；21d时，ICC-CM、ICC-LM以及ICC-SMB均得以部分恢复；28d时，ICC-MP、ICC-CM、ICC-LM以及ICC-SMB得到完全恢复。 7．单纯重组腺病毒Ad-SCL应用或单纯SCF应用，免疫组化染色以及超微结构观察ICC缺失模型小鼠结肠ICC未见明显恢复。 结论： 1．制备的重组腺病毒Ad-SCL对Hela细胞株、体外培养的Cajal间质细胞以及在体器官均有较强的转染效率，并且可以介导SCL基因在Hela细胞株、体外培养的Caial间质细胞以及在体器官中表达。有较好的细胞水平以及在体水平的生物安全性。 2．制备的重组腺病毒Ad-SCL可以上调ICC缺失模型鼠结肠肌条内c-kit蛋白的表达。其机理可能是通过介导SCL基因的表达增加，转而上调了c-kit蛋白表达。 3．联合应用重组腺病毒Ad-SCL和SCF后，ICC缺失模型鼠结肠内ICC得以恢复。联合作用后14d，ICC开始恢复；联合作用后28d，ICC得到完全恢复。单纯腺病毒应用或单纯SCF作用，ICC未见明显恢复。 4．重组腺病毒Ad-SCL介导的SCL转基因联合SCF应用可促进ICC缺失模型鼠结肠ICC恢复。其机理可能与恢复了SCF/c-kit信号通路有关。

目录

论文说明：英文缩写一览表

声明

摘要

前 言

第一部分重组腺病毒Ad-SCL的制备及鉴定

第一节SCL基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

材料与方法

结 果

第二节重组腺病毒Ad-SCL的制备、鉴定

材料与方法

结 果

讨论

小 结

参考文献

第二部分重组腺病毒Ad-SCL转染效率及生物安全性的实验研究

第一节重组腺病毒介导SCL基因在Hela及ICC中的表达

材料与方法

结 果

第二节重组腺病毒Ad-SCL在ICC缺失模型鼠体内的分布和表达

材料与方法

结 果

讨论

小 结

参考文献

第三部分Ad-SCL联合SCF促ICC恢复的在体实验研究

第一节SCL转基因对ICC缺失模型鼠结肠c-kit蛋白表达的影响

材料与方法

结 果

第二节Ad-SCL联合SCF对Cajal间质细胞恢复的影响

材料与方法

结 果

讨论

小 结

参考文献

全文总结

致 谢

文献综述一胃肠道Cajal细胞基础研究进展

文献综述二新一代腺病毒载体研究进展

攻读博士学位期间发表及拟发表的论文