α晶体蛋白对视神经损伤微环境中视网膜小胶质细胞的作用研究

摘要

α晶体蛋白是晶状体来源的“神经保护性物质”之一，它能有效的保护视神经损伤后RGCs细胞并促进轴突的再生；近年来损伤后RGCs周围的小胶质细胞在其再生和修复中的作用受到人们的关注。已有研究表明，中枢神经系统的小胶质细胞在炎症、缺血、变性疾病及损伤后可被激活，一方面产生大量的超氧阴离子、一氧化氮、花生四烯酸衍生物、兴奋性氨基酸以及其它一些潜在的神经毒素，导致神经元死亡，从而加重中枢神经系统的病理损伤；另一方面可以吞噬死亡的神经元碎屑，起到清除的作用。在既往研究中我们意外观察到，α晶体蛋白在保护RGCs的同时，可以抑制视神经钳夹伤模型中吞噬荧光金的小胶质细胞，那么这种作用是直接还是间接的，小胶质细胞的减少对RGCs的保护是否有益?目前尚不清楚。 目的： 通过离体实验和在体模型，观察α晶体蛋白对视网膜小胶质细胞的增殖、活化以及分布的影响，并在蛋白和mRNA水平检测α晶体蛋白对小胶质细胞激活时分泌的TNF-α和iNOS表达的影响，分析α晶体蛋白对视网膜小胶质细胞与RGCs变化的相关性，为α晶体蛋白对视神经损伤后RGCs的保护提供新的理论依据，为临床治疗探索可行性方法。 方法： 1.通过视网膜混合细胞培养和恒温摇床震荡分离的方法培养视网膜小胶质细胞，并通过免疫组化、扫描电镜、流式细胞仪鉴定细胞纯度。 2.离体实验：以离体培养的小胶质细胞为对象，用不同浓度LPS和α晶体蛋白干预，通过MTT分析，细胞计数法摸索合适的LPS、α晶体蛋白工作浓度，研究α晶体蛋白对小胶质细胞的增殖、活化的影响；并通过RT-PCR，ELISA、荧光定量PCR等方法，分析小胶质细胞分泌的TNF-α，iNOS的表达变化。 3.在体实验：以成年LongEvans大鼠为研究对象，建立视神经钳夹损伤模型，玻璃体腔注射10-4g/Lα晶体蛋白，并设立牛血清白蛋白注射为阴性对照；通过视网膜组织切片和全视网膜铺片免疫组化的方法，在损伤后1、2、3、4、6、8周观察α晶体蛋白对小胶质细胞的形态、分布、数量的影响，并分析其与RGCs变化的相互关系。另外，在伤后3周时重复注射α晶体蛋白了解重复注射是否可以抑制视神经损伤4-8周的小胶质细胞，保护RGCs；并通过werstemblot分析各组在损伤后1、2、4、8周视网膜TNF-α，iNOS蛋白释放的情况。 结果： 1.通过视网膜混合细胞培养和恒温摇床震荡分离的方法，成功原代培养并鉴定Long-Evans大鼠的视网膜小胶质细胞：应用GSA-IB4与CD11b细胞化学、流式细胞鉴定小胶质细胞的纯度分别为94.5％、95.8％和91.7％，并且在扫描电镜观察细胞表面呈树突样外观，表明本培养方法可以得到纯度较高的小胶质细胞。 2.与正常对照组相比，浓度为10-2g/L至10-6g/LLPS均可刺激视网膜小胶质细胞的增殖和活化(P＜0.01-0.05)，10-4g/Lα晶体蛋白可以抑制10-6g/LLPS对视网膜小胶质细胞的增殖和活化(P＜0.05)。 3.α晶体蛋白可以降低小胶质细胞激活时细胞上清中TNF-α蛋白的浓度(P＜0.01-0.05)，减少NO的释放(P＜0.05)；并降低小胶质细胞激活时TNF-α、iNOSmRNA的表达。 4.玻璃体腔注射10-4g/L的α晶体蛋白，与牛血清白蛋白注射组比较，在损伤后1-4周可显著减少视网膜小胶质细胞的数量(p＜0.05)，抑制小胶质细胞的迁移和向活化阿米巴样形态的转变，而在损伤后6-8周α晶体蛋白对小胶质细胞的作用不明显。在损伤3周重复注射α晶体蛋白，与单次注射组比较，小胶质细胞的形态无明显改变；但在伤后4周小胶质细胞的数量明显减少(p＜0.05)，伤后6-8周两组间比较无显著统计学差异(p＞0.05)。 5.在伤后1-4周，α晶体蛋白可显著减少视网膜小胶质细胞数量(p＜0.05)，同时增加RGCs细胞的数量，相关性分析发现在视神经损伤后α晶体蛋白对两种细胞的影响存在直线相关。 6.与牛血清白蛋白组比较，损伤后1-4周α晶体蛋白可以降低视网膜TNF-α，iNOS的蛋白的表达(P＜0.01-0.05)，损伤后8周，两组间比较无统计学意义(p＞0.05)。 结论： 1.通过视网膜混合细胞培养和恒温摇床震荡分离的方法，可以成功培养出纯度高的视网膜小胶质细胞。 2.α晶体蛋白可以直接抑制离体培养视网膜小胶质细胞的增殖和活化，并降低细胞上清中TNF-α、iNOS蛋白的浓度及mRNA的表达，提示可能在病理的情况下，α晶体蛋白可以通过抑制小胶质细胞产生TNF-α、iNOS，减轻其对RGCs的损害。 3.α晶体蛋白对视网膜小胶质细胞的抑制作用主要在1-4周，其作用发挥与小胶质细胞的功能状态有关；α晶体蛋白不仅可以抑制视网膜小胶质细胞的增殖、迁移及活化，也能抑制视网膜TNF-α，iNOS的释放，减轻小胶质细胞对RGCs的过度吞噬和继发性损害，可能是视神经损伤后α晶体蛋白间接保护RGCs存活的另一机制。

目录

文摘

英文文摘

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声明

前言

第一部分 Long-Evans大鼠视网膜小胶质细胞的原代培养及鉴定

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第二部分 α晶体蛋白对视网膜小胶质细胞部分生物学功能的研究

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第三部分 α晶体蛋白对大鼠视神经损伤后视网膜小胶质细胞的影响研究

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

全文结论

致 谢

参考文献

文献综述 小胶质细胞与中枢神经损伤

研究生期间发表论文