拮抗细菌主要病原分子中药的筛选及地骨皮抗炎组分的制备与活性研究

摘要

目的：脓毒症是由感染因素介导的全身炎症反应综合征(systemic inflammatoryresponse syndrome，SIRS)，是严重创伤、感染、大手术后的常见并发症，临床死亡率高达50％-60％，至今尚无有效的治疗手段。近年来大量研究证实，G<'->菌的月旨多糖/内毒素(lipopolysaccharide/endotoxin，LPS)、G+菌的肽聚糖(peptidoglycan，PGN)、G<'->菌和G<'+>菌所共有的细菌基因组DNA(cytidine-phosphate-guanosine DNA，CpG DNA)是细菌介导脓毒症的主要病原分子，上述三个病原分子中任何一个单一分子均可介导致死性脓毒症的发生，因此，如能同时有效地拮抗上述三个主要的病原分子，脓毒症的防治就有可能取得突破性进展。 传统中药在拮抗脓毒症方面积累了宝贵的经验，但由于缺乏有效跟踪检测手段，限制了具有潜在抗脓毒症活性中药的深入研究，本课题以介导细菌脓毒症的三种主要病原分子PGN、CpG DNA及lipidA为靶点，应用生物传感器技术平台，从114种抗炎中药中筛选出与上述三种病原分子均具有高亲和力的药物，并以其中与病原分子具有较高亲和力的中药一地骨皮为研究对象，对其进行活性组分的分离制备并对所制备的组分进行初步的拮抗细菌脓毒症的生物学活性研究。 方法：(1)将PGN及CpG DNA包被于生物素样品池，将lipid A包被于非衍生样品池，分别建立以PGN、CpGDNA及lipidA为靶点的技术平台，对114种抗炎中药水提物进行筛选、评价其活性物质含量，并评估出针对上述三种病原分子均具有较高结合活性的中药；(2)利用生物传感器跟踪检测技术、大孔吸附树脂分离技术，从地骨皮中定向分离与PGN、CpG DNA及lipid A均具有较高亲和力的活性组分：在体外实验中，测定不同浓度活性组分与PGN、CpGDNA及lipid A亲和力；MTT法及CCK-8法检测活性组分对RAW264.7细胞活力的影响；ELISA法检测活性组分对PGN(2μg/ml)、CpG DNA(10μg/ml)及LPS(100ng/ml)刺激小鼠RAW264.7细胞分泌TNF-α的抑制作用；在体内实验中，采用尾静脉注射致死剂量热灭活大肠杆菌和热灭活金黄色葡萄球菌，建立细菌脓毒症小鼠模型，观察活性组分对脓毒症模型小鼠的保护作用。 结果：(1)包被后的样品池其共振扫描峰均为尖锐对称的单峰图形，PGN包被的生物素板的包被量约为0.44 ng/mm<'2>，CpG DNA包被的生物素板的包被量约为0.33ng/mm<'2>，lipidA包被的非衍生板(NDC)包被量约为1.19 ng/mm<'2>，结果均符合实验标准，建立了以PGN、CpG DNA及lipid A为靶点的筛选抗炎中药的技术平台。在114种中药中，半枝莲、草果、侧柏叶、地骨皮等22种中药与PGN、CpG DNA及liDid A均具有具有较高的结合活性(RU>100 arc seconds)，其中侧柏叶、石榴皮、地骨皮等7种中药与PGN、CpG DNA及lipid A特异性结合的活性物质含量较高(RU>100 arcseconds)；(2)利用生物传感器技术、大孔吸附树脂分离技术从地骨皮中定向分离得到一个与PGN、CpG DNA及lipid A均具有较高结合活性的E组分。该组分经MTT法测定对小鼠RAW264.7细胞活力无影响(≤400μg/ml)，经CCK-8法测定也对小鼠RAW264.7细胞活力无影响(≤800μg/ml)；对PGN、CpG DNA及LPS刺激小鼠RAW264.7细胞分泌TNF-α有显著的抑制作用，并呈现良好的剂量-效应关系；对致死剂量的热灭活大肠杆菌和热灭活金黄色葡萄球菌攻击小鼠有显著的保护作用。 结论：(1)应用生物传感器，分别成功地建立了以PGN、CpG DNA及lipidA为靶点的筛选抗炎中药的技术平台，其检测高效、客观、可行；(2)从地骨皮中分离制备出一个与PGN、CpG DNA及lipid A均具有较高结合活性的组分E，对该组分初步的生物学活性研究显示，其对细菌脓毒症具有较好的拮抗作用。

目录

论文说明：英文缩写索引

声明

摘要

前 言

第一部分以PGN、CpG DNA及lipid A为靶点筛选抗炎中药

实验一以PGN、CpG DNA及lipid A为靶点筛选技术平台的建立

材料和方法

结果

实验二以PGN为靶点筛选抗炎中药及其活性物质含量评估

材料和方法

结 果

实验三以CpG DNA为靶点筛选抗炎中药及其活性物质含量评估

材料和方法

结 果

实验四以lipid A为靶点筛选抗炎中药及针对三种病原分子的活性物质含量评估

材料和方法

结 果

第二部分地骨皮拮抗细菌主要病原分子组分的分离制备及其生物学活性研究

实验一大孔吸附树脂分离地骨皮组分条件的确定

材料和方法

结 果

实验二地骨皮组分的分离制备及其活性评估

材料和方法

结 果

实验三不同浓度地骨皮E组分与PGN、CpG DNA及lipid A的亲和力测定

材料和方法

结 果

实验四地骨皮E组分对PGN、CpG DNA及LPS刺激小鼠RAW264.7细胞释放炎症细胞因子的抑制作用

材料和方法

结 果

实验五地骨皮E组分对致死剂量热灭活细菌攻击小鼠的保护作用

材料和方法

结 果

讨 论

全文结论

致 谢

参考文献

文献综述 脓毒症的分子机制及治疗进展

研究生期间发表的文章