以脱矿脱细胞骨基质环为支架构建组织工程化椎间盘纤维环的实验研究

摘要

下腰痛是现代社会中一种常见病和多发病，流行病学调查发现不但在老年发病率高，而且在青壮年中发病率也非常高，成为导致劳动力丧失的主要原因之一。下腰痛最主要的原因是椎间盘疾病，其中腰椎间盘突出症等椎间盘退变性疾病(diScdegeneration disease，DDD)是最常见的椎间盘疾病。随着我国老龄化进程的发展，DDD越来越成为严重影响人民生活和生产的疾病。 目前治疗DDD的方法主要有药物、封闭、理疗和手术，其中手术治疗是最有效和最普遍的治疗方法。即使是近几年开展的椎间盘微创手术仍然破坏了椎间盘的结构。手术的后果是椎间隙变窄，脊柱生物力学功能紊乱、退变加速，最终导致不稳需要融合手术稳定节段。融合手术的代价是运动功能的丧失，这种治疗方法与功能重建的现代医学发展方向背道而驰。人工椎间盘假体的远期效果难以令人满意。同种异体椎间盘移植术存在免疫排斥反应和传播疾病的可能，更重要的缺点是来源有限和伦理f可题。理论上使用组织工程学技术对椎间盘的生物学修复是最为理想的治疗方法。因此，研究并开发组织工程椎间盘，对椎间盘进行生物学修复和功能重建，已成为治疗退行性椎间盘疾病理想的解决方案。 椎间盘包括纤维环和内部的凝胶样核心．髓核两个部分。理论上，纤维环的再生修复是椎间盘组织工程首先要研究的问题，因为破损的纤维环没有自身修复和再生的能力，缺少纤维环的包容，没有任何方法能够让髓核组织填充并保持在椎间隙。只有纤维环完整结构得到恢复的条件下，不同程度的DDD才能进一步治疗：对于椎间盘病变的早期，如果只有纤维环破裂而没有髓核突出，可以使用组织工程化技术来修复纤维环，对髓核的病变可采用刺激逆转退变的治疗，比如各种生长因子的注射、基因修饰细胞注射等；对于病变的晚期，髓核已经突出或脱出需要摘除髓核，就需要组织工程化纤维环和组织工程化髓核共同移植才能达到治疗目的。 脱矿骨基质明胶作为支架材料应用在软骨组织工程，在体外成功构建了软骨组织块，证实了脱矿骨基质明胶具有同种异体骨来源广泛、降解过程不会出现其他支架材料的毒性、可以冷冻后长期保持生物学和生物力学性能等特点，肯定了其良好的性能。脱细胞天然组织作为组织工程支架材料在肌腱、血管等的组织工程研究中已经成功广泛应用。能否使用脱矿、脱细胞骨基质作为支架材料用于组织工程化纤维环的构建研究?此支架有何材料和生物力学特点?种子细胞能否粘附支架内部并增殖和行使功能?鉴于文献中没有此方面的报道，为了回答以上问题，本研究使用组织工程学、分子生物学、细胞培养等技术，从制备兔脱矿、脱细胞骨基质环入手展开研究。首先，获得了具有合适理化性能以及低免疫源性的纤维环支架材料。其次，分离培养了兔椎间盘纤维环细胞，在体外进行单层培养和扩增，得到了表型稳定、增殖活力强、数量充足的种子细胞。再次，分别使用静态沉淀法和纤维蛋白凝胶接种技术构建细胞支架复合体，证实了两种方法均能实现细胞粘附和扩增，但后者细胞黏附数量更多、分布更均匀、增殖更快。最后，将构建的细胞支架复合体分别进行体外静态培养和裸鼠皮下培养，经过鉴定证实培养产物为类纤维环组织，更深入地证实了种子细胞在支架内增殖并能够行使生物学功能，其中裸鼠皮下培养产物更接近纤维环组织。 研究取得的主要结论总结如下： 1．经过脱矿脱细胞塑形等处理获得了与纤维环外形一致的具有多孔结构的支架材料，外周较为致密，有一定的力学强度，内层疏松便于种子细胞种植，环行结构内部空隙为以后组织工程髓核提供空间。其在平均孔径、孔隙度、吸水力等指标上达到了支架材料的要求。具有一定的弹性和未明显下降的降解性。材料的免疫源性比较低，未产生强烈的免疫炎症反应。初步达到了支架材料的基本要求，为进一步深入进行组织工程纤维环的研究奠定了实验基础。 2．从兔取椎间盘纤维环组织，使用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶两步酶消化法分离取得纤维环细胞进行接种培养。原代培养的细胞增殖较慢。传代培养的第一代细胞，形态与原代相似，细胞活力未显著下降，具有纤维环细胞的表型特点。第一代细胞增殖汇合速度较原代细胞明显加快，可以快速扩增大量细胞用于组织工程化纤维环的研究。本实验为后续研究提供了表型稳定和数量充足的种子细胞。 3．使用培养的第一代纤维环细胞作为种子细胞以及脱矿、脱细胞骨基质环为支架材料，分别使用静态接种技术和纤维蛋白凝胶种植技术构建细胞支架复合体，均可实现细胞黏附于支架并在支架内增殖。采用纤维蛋白凝胶种植技术构建细胞支架复合体较静态接种技术可以使细胞黏附数量更大，分布更加均匀，并且细胞增殖更快。本实验为更好地进行进一步的培养创造了更为有利的条件。 4．采用纤维蛋白凝胶种植技术构建的细胞支架复合体，使用体外静态培养方法得到的产物经过检测证实培养产物组织内的细胞能够保持表型特点、逐渐增殖和行使功能，产物可以鉴定为类纤维环组织。 5．采用纤维蛋白凝胶种植技术构建的细胞支架复合体，通过裸鼠皮下培养得到的产物，经检测细胞能够保持表型特点、逐渐增殖和行使功能，支架材料大部分吸收，产物较体外培养更接近纤维环组织。组织内细胞增殖持续时间较体外培养长，功能产物分泌更多，所以较体外培养效果更好，从而更好地为生物学修复纤维环奠定基础。

目录

论文说明：英文缩写词一览表

声明

摘要

前 言

第一部分脱矿脱细胞骨基质环细胞支架的制备和检测

前 言

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

参考文献

第二部分兔椎间盘纤维环细胞的培养和鉴定

前 言

材料和方法

结 果

讨论

小 结

参考文献

第三部分细胞支架复合体的构建

前 言

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

参考文献

第四部分细胞支架复合体体外培养及产物检测

前 言

材料与方法

结 果

讨论

小结

参考文献

第五部分细胞支架复合体裸鼠体内培养及产物检测

前 言

材料与方法

结 果

1.形态学观察

2.生化指标：羟脯氨酸含量、GAG含量、DNA含量

3.基因表达：RT-PCR检测Ⅰ、Ⅱ型胶原基因表达

4.蛋白表达：western-blot检测Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白表达

讨 论

小 结

参考文献

全文结论

致谢

文献综述椎间盘生物学修复的研究进展

博士研究生期间发表的文章