反义Cubilin RNA对阿霉素肾病大鼠肾小管间质损伤干预作用的研究

摘要

长期大量蛋白尿是导致慢性肾衰竭的独立危险因素。持续性大量蛋白尿是肾小管间质损伤的主要原因，可以诱导肾小管上皮细胞转分化或凋亡；可通过激活肾小管上皮细胞启动肾间质炎症反应并活化间质成纤维细胞，最终导致间质纤维化的发生。肾小管周围毛细血管网(PTCs)是肾间质的主要构成组分，在组织学上管周微血管内皮细胞与肾小管比邻。近年研究证实，PTCs丢失是慢性肾病间质纤维化的重要原因，但目前还不十分清楚蛋白尿是否也可以通过活化肾小管上皮细胞进而损伤管周微血管网。我们前期工作显示，高浓度白蛋白可活化肾小管上皮细胞产生大量ROS抑制共培养体系中内皮细胞增殖，诱导凋亡，并抑制内皮细胞形成管样结构。另外，在肾病综合征患者，管周微血管内皮细胞的增殖活性明显降低，管周微血管密度显著减少，后者与肾小管上皮细胞胞浆内吞饮的白蛋白量呈显著负相关关系，提示尿蛋白的活化肾小管上皮细胞可能与慢性肾病肾间质微血管损伤之间存在某种内在联系。 白蛋白是尿蛋白主要成分，对肾小管上皮细胞具有直接损伤作用。研究表明，白蛋白被超负荷重吸收是其损伤肾小管上皮细胞的主要途径。Cubilin是负责肾小管上皮细胞吞饮白蛋白的受体，生理状态下对白蛋白的重吸收具有“开关”作用。在前期实验中我们发现cubilin可能在介导白蛋白激活肾小管上皮细胞中具有重要作用。本实验我们将进一步观察反义cubilin腺病毒载体对阿霉素肾病大鼠肾间质炎症反应和管周微血管损伤的影响，旨在为阐明蛋白尿相关性肾损伤的机理并寻找可能的干预措施提供科学依据。 一、实验方法 1、SD大鼠随机分为五组：正常对照组、阿霉素模型组、空载体组、pAdEasy-cuB组和pAdEasy-ACUB组，每组18只。对照组注射相同剂量生理盐水外，其余各组经尾静脉一次性注射盐酸阿霉素(7.5mg/kg)，复制阿霉素肾病模型。于建模第3天，空载体组、pAdEasy-CUB组和pAdEasy-ACUB组分别经。肾动脉灌注pAdEasy-l、pAdEasy-Cub和pAdEasy-Acub(1.5×1011pfu/kg)，对照组和模型组灌注等量生理盐水。 2、各组随机选取5只大鼠，于实验第0、7、14、21、28天收集24h尿液，测定24h尿蛋白水平。各组随机选取5只大鼠，于实验第7、14、28天断头处死，从心脏采血收集血清，测定血清总蛋白、白蛋白、尿素氮和肌酐；同时留取左肾，取部分肾组织作冰冻切片，另取肾组织置10％福尔马林中固定备用。 3、激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况，判断腺病毒转染效果。常规方法行PAS染色；肾小管上皮细胞cubilin表达，MCP-1表达采用免疫组化SP法检测，JG12表达以及肾组织ED-1表达采用免疫组化二步法检测，肾小管上皮细胞白蛋白沉积采用免疫组化直接染色法检测。肾小管间质损伤评分、微血管密度(MVD)和ED-1阳性细胞计数按参考文献报道的方法计算。 二、结果 1、正、反义cubilin转染肾小管上皮细胞的鉴定 腺病毒转染第3天激光共聚焦显微镜下观察到空载体组、pAdEasy-CUB组和pAdEasy-ACUB组肾小管有较强的绿色荧光蛋白表达，而对照组和模型组仅见微弱的自发荧光，表明阿霉素肾病大鼠肾组织腺病毒成功转染。 2、反义cubilin对阿霉素大鼠尿蛋白、肾功能和病理改变的干预作用 与对照组比较，模型组、空载体组、pAdEasy-CUB组和pAdEasy-ACUB组24h尿蛋白水平随时间变化显著升高(P＜0.01)，同时血清Cr、血清BUN也进行性增高(P＜0.01)。与模型组比较，pAdEasy-ACUB组尿蛋白水平虽显著升高(P＜0.01)，但血清Cr、血清BuN显著降低(P＜0.05)。光镜下，模型组、空载体组、pAdEasy-CUB组可见部分小管扩张及空泡样变性，局部区域可见尿蛋白形成的透明管型，间质水肿、扩大，炎细胞弥散或灶性浸润；而pAdEasy-ACUB组上述病理改变明显减轻。 3、反义cubilin对肾组织cubilin表达和白蛋白吞饮的抑制作用 与对照组比较，模型组、空载体组和pAdEasy-CUB组肾小管上皮细胞cubilin表达明显上调(P＜0.01)，胞浆内吞饮白蛋白显著增加(P＜0.01)。相关性分析显示，肾小管上皮细胞白蛋白沉积与cubilin表达呈显著正相关(γ=0.780，P＜0.01)。与模型组比较，pAdEasy-ACUB组肾小管上皮细胞cubilin表达显著降低，胞浆中吞饮的白蛋白减少(P＜0.01)。 4、反义cubilin对阿霉素大鼠肾间质炎症反应的干预作用 与对照组比较，模型组、空载体组和pAdEasy-CuB组肾小管上皮细胞表达MCP-1显著增多，肾间质ED-1阳性细胞显著增多(P＜0.01)。肾小管上皮细胞MCP-1表达、肾间质ED-1阳性细胞数与白蛋白沉积呈显著正相关(γ值分别为γ1=0.775、γ2=0.863，P＜0.01)。与模型组比较，pAdEasy-ACUB组肾小管上皮细胞MCP-1表达和ED-1阳性细胞浸润均显著减少(P＜0.01)。 5、反义cubilin对阿霉素大鼠肾间质微血管病变的干预作用 与对照组比较，模型组、空载体组JG-12阳性管周微血管数明显减少，(P＜0.01)。管周微血管数与肾小管上皮细胞吞饮白蛋白、肾小管间质损伤评分呈显著负相关(γ，值分别为γ1=-0.728、γ2：-0.851，P＜0.01)。与模型组比较，pAdEasy-ACUB组JG-12阳性管周微血管数明显增加(P＜0.01)。 三、结论 1、反义cubilinRNA可抑制阿霉素肾病大鼠肾小管上皮细胞cubilin的表达以及对白蛋白的吞饮。 2、反义cubilinRNA可下调阿霉素肾病大鼠肾小管上皮细胞MCP-1的表达，减轻肾间质炎症反应，保护管周微血管网。提示通过抑制吞饮受体cubiljn表达可以减少阿霉素大鼠肾小管上皮细胞超负荷吞饮白蛋白，对蛋白尿相关性肾小管间质损伤具有一定的保护作用。

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文献综述 蛋白尿在慢性肾脏病进展中的作用

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