幼年新西兰白兔损伤关节软骨再生相关基因cDNA差示文库构建及部分相关基因分析

摘要

研究背景：关节软骨损伤后的修复一直是医学界面临的难题之一，关节软骨损伤后不能得到良好修复及功能恢复的关键问题在于：目前尚无有效的方法使损伤部位形成永久性的透明软骨关节面。根据文献报道，软骨细胞在特定的环境下可以去分化为成软骨细胞，因此，寻找软骨细胞去分化的激活因子和诱导机制成为解决关节软骨损伤后自然修复的关键问题。据国外文献报道，幼年新西兰白兔关节软骨损伤后修复关节面中透明软骨含量达80％以上，修复组织的结构和耐久度均接近正常关节软骨，而成年新西兰白兔关节软骨损伤后只有少量纤维软骨组织修复。推测在幼年和成年动物关节软骨损伤后的修复过程中，存在修复相关基因表达的差异导致修复结果不同。研究具有明确软骨再生修复能力的动物模型损伤软骨局部早期的基因表达，有可能发现软骨再生修复的关键基因，并进一步研究其修复机制，具有重要的理论意义和应用价值。 目的：利用抑制性消减杂交技术研究幼年新西兰白兔膝关节软骨损伤后差异表达基因，构建幼年新西兰白兔损伤关节软骨的差减基因片断文库，筛选克隆主导幼年新西兰白兔膝关节软骨损伤后自然修复的相关基因，为后续课题研究奠定基础和研究平台。 方法：采用一步法和PlantRNAout相结合的方法提取损伤关节软骨组织总RNA，采用SMART与SSH相结合的方法，分离幼年新西兰白兔损伤膝关节软骨修复过程中差异表达基因。具有亲子关系的50周龄成年新西兰雌性白兔及其子代8周龄幼年新西兰白兔(雌雄不限)共3对。用直径3mm钻头在膝关节股骨关节面背侧造成直径3mm深3mm的关节软骨组织及软骨下骨的缺损，取损伤后4周损伤部位关节软骨修复组织作为实验标本。幼年新西兰白兔的修复组织为Tester组，即检测子；成年亲代雌性新西兰白兔的修复组织为Driver组，即驱动子。用RsaⅠ酶使cDNA切割成为具有平头末端的小片段后，将Tester分为两份并分别在其平头末端连上不同的接头Adaptor1或Adaptor2R，与酶切后的Driver进行两轮消减杂交和两轮抑制性PCR扩增，富集差异表达基因，并将PCR产物与pMD19-T载体进行T/A连接，连接产物转入感受态大肠杆菌DH5α中，经蓝白斑实验初步筛选，挑选阳性克隆，阳性克隆菌扩增后建立消减cDNA文库，PCR验证阳性克隆插入片断，并送上海生物工程公司测序。测序结果通过Chromas软件去除载体序列及插入片断两端的接头序列得到EST片断，用DNAStar5.01对EST片断进行分析，去除冗余的重复序列得到差显基因片断，并在GeneBank数据库中进行同源性检索，反向Northern斑点杂交验证差显基因表达情况，对差异表达基因进行分析，选择有意义的目的基因片断进行后续全长基因克隆和功能研究。 结果：用一步法结合plantRNAout法提取的总RNA纯度高、完整性和稳定性好，成功逆转录合成双链cDNA。用SMART与SSH相结合的方法成功地构建了幼年新西兰白兔损伤关节软骨修复过程中差异表达cDNA文库。蓝白斑实验获得223个阳性克隆菌落，随机选择64个克隆进行PCR验证，90％克隆均有插入片断。共送217个阳性克隆测序，成功测序199个。测序后分析得到20个差异表达基因片断，其中1个为单引物扩增序列，通过同源性检索鉴定了13个(其中包括1个载体序列和6个无意义基因，分属于线粒体基因、核糖体基因、表达载体基因和管家基因等)，发现6个未报道基因片断。反向Northern斑点杂交证明，20个差异表达基因片断中有18个在幼年新西兰白兔损伤关节软骨组织表达，2个假阳性差显片断被排除。幼年新西兰白兔损伤关节软骨与其亲代雌兔比较，特异性表达的基因有3个，均为未报道基因序列，9个基因表达上调，其中包括3个未报道基因片断。差显基因片断均在GeneBank登录并获得注册。 结论： 1、一步法结合plantRNAout的总RNA提取方法，简便、快速、经济，适合富含多糖的关节软骨组织小量高质量的总RNA提取。 2、用SMART和SSH相结合的办法成功的构建了含有199个克隆的幼年新西兰白兔损伤关节软骨修复组织cDNA差异表达基因文库。 3、分析文库中的基因，发现幼年新西兰白兔关节软骨损伤后4周，基因表达较成年兔明显活跃，差异表达基因包括钙离子结合蛋白、皮质稳定素4、Ⅰ型胶原α2链、Ⅺ型胶原α1链等。部分基因与软骨细胞的新陈代谢和细胞外基质的合成密切相关。 4、发现了6个未报道EST序列，在GenBank中成功注册。 5、反向Northen斑点杂交提示有3个差显EST片断在幼年新西兰白兔损伤关节软骨特异性表达，而成年新西兰白兔不表达，此部分基因很有可能是主导幼年新西兰白兔关节软骨修复的相关因子，进一步研究这3条基因具有重要意义。

目录

文摘

英文文摘

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声明

前 言

第一部分 幼年新西兰白兔膝关节软骨损伤后再生修复组织差显cDNA文库构建

材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

第二部分 幼年新西兰白兔膝关节软骨损伤后再生修复组织差显基因测序及分析

材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

全文结论

致 谢

图 片

文献综述 关节软骨损伤的修复和基因治疗研究进展

攻读硕士期间发表的文章