应用MLST系统进行中国幽门螺杆菌的分子流行病学研究

摘要

目的： 幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，H.pylori)是一种螺旋状、微需氧、革兰阴性杆菌，属于螺杆菌属，定植于人胃黏膜表面。人类是其唯一的天然宿主，现已证实H.pylori感染与慢性胃炎、消化性溃疡和胃黏膜相关组织淋巴瘤(MALT)的发生密切相关。幽门螺杆菌的致病性主要体现在毒力因子和机体的遗传易感性两个方面。人类对H.pylori普遍易感，但感染后的症状轻重各不相同，表现出明显的致病性差异，轻者可长期无症状携带，重者可引起慢性胃炎、溃疡甚至胃部肿瘤。其原因与菌株型别的毒力强弱相关，和宿主的遗传易感性有紧密的相关性，从而导致了H.pylori的感染致病存在人种、地域、环境卫生、营养等显著差异性。 近年来发展较快的分子生物学技术为细菌的分型提供了强大的工具，分型结果可达到基因水平。多位点序列分型(Multilocussequencetyping，MLST)具有很高的分辨能力，既适用于流行病学研究，也可用于分子进化学的研究. 因此，本研究拟应用MLST系统对不同地区分离的H.pylori菌株进行基因水平的分型，确定不同地区感染H.pylori的主要类型，并与国际流行克隆株进行比较，了解它们的遗传背景和可能的来源，使得流行病学研究可以从表型特征的鉴别深入到基因特征的鉴定，探索基因在核酸水平的变化过程。 方法： 1.收集4个不同地区(北京、重庆、广州、上海)的幽门螺杆菌感染患者的临床分离株。在患者进行胃镜检查时取胃窦部的活检组织，标本在含5％兔全血的BHI培养基上培养4d.阳性菌株置于-70℃条件保存。 2.复苏保存的H.pylori菌液，传代培养后提取细菌基因组DNA，采用天成公司的细菌基因组DNA提取试剂盒进行操作。 3.根据文献筛选幽门螺杆菌的8个看家基因作为MLST的目的基因，分别为atpA，efp，mutY，ppa，trpC，ureI，vacA，yphC。分别扩增8个基因的内部核酸序列片段，从398bp～627bp。获得的PCR扩增产物均进行核酸纯化和DNA序列分析。将DNA序列信息进行MLST分析，得到菌株的等位基因图谱。确定H.pylori临床分离株的序列分型(SequenceType，ST)，并与国际菌株进行比较。应用BURST(BasedUponRelatedSequenceTypes)运算规则将菌株归为各个谱系组(clonalcomplex)，应用START程序计算相关系数(indexofassociation，Ia)并进行系统进化树的构建。 4.针对vacA基因信号区及中间区序列设计引物，检测H.pylori的等位基因，vacAs1a、vacAs1b、vacAs2、vacAm1、vacAm2。确定菌株所属的vacA基因亚型。 结果： 1.PCR扩增所筛选的H.pylori的8个管家基因的核心核酸片段，对40株H.pylori临床分离株进行MLST分析，8个基因座位多态性位点从atpA的1.77％到mutY的3.86％不等。一共获得了38个STs序列型，均为在幽门螺杆菌MLST数据库中未报道的。 2.菌株核酸序列的ST型结果按类平均数聚类方法(UPGMA)绘制进化树，得到的样本菌株树形聚类图，显示了菌株的亲缘关系，可将40株H.pylori菌株大致分为三大类。 3.vacA基因分型结果，vacAs1a阳性为33株(82.5％)，vacAs1b阳性为7株(17.5％)，vacAm2阳性为39株(97.5％)，未发现s2型菌株，其中标准株NCTC11637和11638的结果为vacAs1a/ml型。 结论： 1.首次应用MLST的方法对中国4个大城市的H.pylori临床分离株进行了研究，本实验中等位基因的多样性与H.pyloriMLST数据库中之前的研究结果差异不大。所得到的STs序列型，不属于原有的谱系。同时Singleton序列型在本实验中占了大部分(95％)，与其它基因型相比它们代表了遗传距离较远的基因型。 2.对幽门螺杆菌菌株进行了vacA基因分型，结果以s1a/m2型为主，消化性溃疡组与慢性胃炎组之间s1a型有显著性差异，而m2型差异无显著性。提示可能从消化性溃疡患者胃粘膜标本中分离出vacAs1a型的可能性高于其他慢性胃炎的患者，而vacAm1、m2型则与H.pylori相关胃部疾病的相关性不大。 3.由于样本量的限制，vacA基因分型结果与MLST序列型之间未发现明确关联，但是可以相信随着H.pyloriMLST数据的增加，可以更加明确基因型间的遗传相关性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略表

声明

前言

第一部分幽门螺杆菌的多位点序列分型平台的建立

材料与方法

实验结果

讨论

小结

第二部分vacA基因型多态性的检测

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

小结

第三部分本研究存在的不足与展望

致谢

参考文献

文献综述 病原微生物基因多位点序列分型的研究进展