HCV5’非翻译区靶向性M1GS核酶构建及其胞内反义活性的研究

摘要

根据HCV基因组5’非翻译区(5’UTR)的序列,借助计算机软件模拟,设计并构建了一组针对该区序列中不同靶位的人工M1GS核酶(M1GS-HCV/C20、M1GS-HCV/C67、M1GS-HCV/C76、M1GS-HCV/T86、M1GS-HCV/C89和M1GS-HCV/T160)。通过双酶切、PCR及测序等方法证实,所构建的这六种M1GS重组质粒均克隆成功。此外,截取包括HCV5’UTR在内的部分基因片段,将其成功插入至pGEM-9z(f)质粒的MCS中,构建了含有底物DNA片段的另一个重组质粒—pGEM-HC。分别将各M1GS重组质粒的转录产物与pGEM-HC质粒的转录产物在体外混合,结果发现M1GS-HCV/C20、M1GS-HCV/C67和M1GS-HCV/C76三种人工核酶显示出对底物RNA片段的切割活性,其中M1GS-HCV/C67和M1GS-HCV/C76活性相对较高,而M1GS-HCV/T86、M1GS-HCV/C89和M1GS-HCV/T160这三种人工核酶则没有明显的切割活性。进一步将体外初筛有效的三种M1GS核酶基因插入逆转录载体质粒pLXSN中,构建相应的M1GS真核表达载体。与此同时,将HCV5’UTR的DNA片段插入至pGEF-N1质粒的绿色荧光蛋白基因的上游,成功构建了受控于HCV5’UTR的绿色荧光融合表达载体。再分别将各M1GS真核表达载体与该绿色荧光融合表达载体通过脂质体共转染Hela细胞(同时以表达红色荧光蛋白的质粒pDsRed2-C1作为转染的内对照),建立了一种有效的M1GS核酶胞内复筛系统。通过荧光显微观察绿色荧光的变化,并进一步通过Typhoon9200对各组细胞中绿色荧光的表达强度进行扫描。结果发现:核酶M1GS-HCV/C20和M1GS-HCV/C76可大大抑制绿色荧光蛋白的表达,抑制率分别为77.54±1.97％和80.35±1.48%,而核酶M1GS-HCV/C67对绿色荧光的抑制作用则相对较弱,仅为58.82±0.88%。此外,实验过程中还针对M1GS核酶与底物在体外进行切割反应的条件作了一些探索。
　　总之,本研究成功构建并筛选的三种M1GS核酶,不仅在体外可实现对HCV基因组5’UTR的靶向切割、而且再胞内也同样具有明显的反义抑制效应,从而为新型抗HCV反义药物的进一步研究与开发奠定了基础。

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前言

研究内容

第一部分 M1GS核酶体外切割活性的研究

一、材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

二、结果与分析

1 靶基因的选择

2 GS结合靶位的确定

3 靶基因二级结构的模拟

4 M1GS核酶基因PCR引物的设计

5 M1GS核酶基因重组质粒的鉴定

6 M1GS核酶的体外转录

7 32P标记的底物RNA的鉴定

8 RNA marker的制备

9 ptRNAser基因克隆的鉴定与体外转录

10 M1 RNA体外切割活性的鉴定

11 人工核酶M1GS对底物的体外切割

三、讨论

1 关于GS的设计

2 RNase P的体外活性鉴定

3 RNase P最佳反应时间的摸索

4 胞外切割系统的建立

第二部分 M1GS核酶胞内活性的初步研究

一、材料及方法

1 实验材料

2 实验方法

二、结果与分析

1 M1GS-pLXSN质粒的PCR鉴定

2 pHCV5’UTR-EGFP重组质粒的鉴定

3 转染细胞内M1GS核酶表达的鉴定

4 M1GS核酶对靶基因表达的抑制作用的检测

四、讨 论

小结

二、展望

附 录（Appendix）

参考文献

附录四：在读硕士期间发表科研论文

致谢