支气管肺泡干细胞的鉴定、分离及其微RNA表达谱的初步研究

摘要

目的：我们拟从肺干细胞入手，首先，通过双重免疫荧光染色技术鉴定临床肺癌组织和鼠正常肺组织中DPCs的存在；以此为基础，分离、鉴定小鼠的DPCs细胞(即BASCs)；流式细胞仪分选出BASCs；微阵列技术检测BASCs的miRNAs表达情况，并应用实时定量荧光PCR技术(quantitativereal-timepolymerasechainreaction，qRT-PCR)进行验证；生物信息学初步预测所选miRNAs的功能及其作用靶点，最后通过荧光素酶报告基因载体进行验证。本研究以临床肺癌组织发现具有干细胞表面分子标志的DPCs细胞为基础，进一步以肺干细胞特征性miRNAs为突破点研究小鼠正常肺干细胞发生恶性突变的分子机制，不仅鉴定了正常小鼠肺干细胞的miRNAs表达谱，而且为后续深入探讨miRNAs调控干细胞自我更新和分化及肺干细胞向肺癌干细胞转变的分子机制奠定了基础。 方法： 1.双重免疫荧光染色法鉴定人肺癌组织内CCA+SP-C+细胞(DPCs)：取人的正常肺组织、肺鳞癌、肺腺癌的癌组织和其各自对应的癌旁组织，冰冻切片，进行双重免疫荧光染色，通过激光扫描共聚焦显微镜观察肺内是否存在DPCs细胞。每例标本观察时镜下随机选择4～6个视野，计数100个肺细胞，得出每百个细胞内DPCs百分率，采用SPSS11.0统计软件包对数据进行分析。 2.小鼠BASCs的培养鉴定和分选：取成年鼠(小鼠、大鼠)、新生鼠(小鼠、大鼠)的正常肺组织，双重免疫荧光染色法鉴定BASCs。采用胶原酶和分散酶联合消化小鼠肺组织制备肺单细胞悬液，经免疫磁珠分选Sca-1+细胞；胶原蛋白预先包被培养板；无血清乳腺上皮细胞培养基培养Sca-1+细胞；双重免疫荧光染色CCA和SP-C鉴定BASCs；通过流式细胞仪分选CD45￣CD31￣Sca-1+CD34+细胞(即BASCs)，CD45￣CD31￣Sca-1￣CD34￣细胞作为对照。 3.小鼠BASCsmiRNAs表达谱的鉴定：将分选出的细胞常规提取RNA后，经YM-100(Millipore)微离心过滤柱抽提小于300核苷酸长度的小RNA；微阵列法检测BASCs和其对照细胞的miRNAs表达谱，筛选出差异miRNAs；构建miRNAs特异性TaqManMGB探针，qRT-PCR法验证所选差异miRNAs在两种细胞的表达；生物信息学初步预测被选miRNAs的功能及其作用靶点(WEE1基因)；最后通过荧光素酶报告基因载体进行验证。 结果： 1.CCA+SP-C+细胞(DPCs)存在于人肺腺癌组织中：通过双重免疫荧光染色法在人的肺腺癌组织、正常肺组织中首次发现了DPCs，而在鳞癌组织中未见DPCs；在人的肺癌组织中DPCs数量明显多于相对应的癌旁组织(P＜0.05)。 2.建立了小鼠BASCs的鉴定、分离和培养方法：在成年鼠和新生鼠的正常肺组织中均发现了BASCs，其主要定位于BADJ区；通过胶原酶和分散酶联合消化小鼠肺组织，平均每只成年小鼠可得到有核细胞总数为1.6～1.8×107；经磁珠分选后的细胞其表面分子Sca-1+表达的阳性细胞百分率明显高于未经分选的肺单细胞(87.3％±5.9％vs9.6％±1.8％，P＜0.05)；在无血清乳腺上皮细胞培养基中Sca-1+细胞在第6天可形成BASCs克隆和其他未知的细胞克隆；在有血清的条件下BASCs可分化为AT2细胞；流式细胞仪检测CD45￣CD31￣Sca-1+CD34+细胞占肺细胞总数的0.7％～1.1％，根据此分子标记能够分选出纯度约98％的BASCs。 3.建立了小鼠BASCs的miRNAs表达谱：从BASCs和对照细胞中分别提取小RNA220ng和720ng，微阵列法检测miRNAs的表达并比较差异；以对数(log2)为差异倍数，比较BASCs和其对照细胞，共发现116个miRNAs的表达具有显著性差异(P＜0.01)，其中有56个miRNAs在BASCs高表达，60个miRNAs在BASCs低表达。在这些差异miRNAs中选取了10个与细胞周期、干细胞分化、肿瘤发生相关的miRNAs，即：miR-142-3p，miR-451，miR-106a，miR-142-5p，miR-15b，miR-20a，miR-106b，miR-25，miR-486和miR-497；通过qRT-PCR法检测其在BASCs和对照细胞中的表达，结果显示在BASCs中miR-497高表达，而其余9个miRNAs即miR-142-3p，miR-451，miR-106a，miR-142-5p，miR-15b，miR-20a，miR-106b，miR-25，miR-486在BASCs中低表达；qRT-PCR的检测结果与miRNAs芯片检测结果一致。生物信息学初步分析所选差异miRNAs的作用靶点和功能。随后，我们选取了在BASCs高表达的miR-497，通过miRNAs靶基因预测软件(TargetScan、MiRbase、miRanda)预测其作用靶点，取所有3个软件均预测到的Weel做为靶基因，最后通过荧光素酶报告基因载体验证预测靶基因的准确性(荧光素酶验证预测靶基因的实验尚在进行中)。 结论： 本研究首次在人的肺腺癌组织中发现了DPCs，而且证实了DPCs在鼠肺中存在的广泛性；初步建立了小鼠DPCs(即BASCs)体外克隆培养体系；通过微阵列法鉴定了小鼠BASCs的miRNAs表达谱，与对照细胞相比，发现116个miRNAs的表达具有显著性差异(56个高表达，60个低表达)；初步证实miR-497可能通过靶基因Weel调控BASCs的自我更新和分化。本课题不仅为深入研究miRNAs调控小鼠肺干细胞的自我更新和分化建立了实验平台，而且为进一步探讨人肺干细胞、miRNAs在肺癌发生中的作用提供了借鉴，有望为肺癌的早期诊断、预后监测及靶向治疗提供新的分子靶点。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语索引

声明

前 言

第一部分 双重免疫荧光染色法鉴定人肺癌组织内CCA+SP-C+细胞

实验材料

实验方法

实验结果

讨 论

小 结

第二部分 小鼠支气管肺泡干细胞的培养鉴定和分选

实验材料

实验方法

实验结果

讨 论

小 结

第三部分 小鼠支气管肺泡干细胞miRNAs表达谱的鉴定和生物信息学分析

实验材料

实验方法

实验结果

讨 论

小 结

全文总结

致 谢

参考文献

文献综述 肺干细胞研究进展

攻读博士学位期间发表及待发表文章