SV40T抗原基因诱导可逆性永生化黑素细胞的生物学特征评价

摘要

正常细胞在体外培养时生命期是有限的，细胞增殖一段时间后会出现群体生长缓慢，有丝分裂停滞，进而衰老死亡，这种现象叫做复制衰亡(replicativesenescence)。细胞的这种生物学现象导致一些体外培养的细胞因生长增殖能力衰竭、数量不足而不能充分满足实验研究和临床运用的要求。后来人们观察到一些肿瘤细胞具有持续生长和增殖的能力，可长期传代，即细胞的永生化(immortalization)。进一步研究发现部分永生化的肿瘤细胞中含有病毒基因(virusgene)，因此通过转染技术将病毒基因导入并整合在体外培养的正常细胞基因组上，使其出现永生化就成为了细胞实验研究的热门。 猿猴病毒40(simianvirus40，SV40)是60年代初发现和分离的猴肾细胞病毒，人是其自然宿主。SV40的基因组能编码T(LargeT)和t(smallt)抗原。T抗原具有ATP酶和DNA解旋酶活性，使蛋白质丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化、ADP核糖基化和己酰基化。T抗原还有活化宿主细胞核糖体基因、诱导DNA合成、修饰蛋白质合成起始因子等作用。t抗原能反式激活RNA多聚酶基因的启动子，以及c-myc和c-fos癌基因转录，使细胞质肌动蛋白缺失和细胞粘附性下降。T抗原为细胞转化启动所必需的，对转化起决定作用，而且转化细胞表型的维持必须要T抗原的连续表达。t抗原对细胞的转化是非必需的，但可起加强作用，两者共同维持转化表型。因此SV40T抗原基因被广泛运用于诱导人类和动物细胞的永生化。 SV40T抗原引起细胞转化是一个复杂的过程，目前仍不完全清楚其机制。一些研究发现SV40T抗原能与肿瘤抑制因子pRb和p53相互作用，影响它们调控正常细胞生长周期和细胞凋亡的功能，也有研究认为SV40T抗原基因可通过调节端粒酶的活性使细胞的端粒长度得到维持。细胞的永生化被认为可能是向肿瘤细胞转化的必经阶段，因其安全性受到质疑制约了转化细胞运用于临床的前景。 我科前期实验利用位点特异性重组酶Cre/loxP系统联合SV40T抗原基因成功构建了可逆性永生化黑素细胞(reversibleimmortalizedmelanocytes，RIMC)。其基本原理是利用基因打靶技术，引入Cre/loxP系统，该系统具有高度保守性和特异性，可准确的根据loxP位置切除整合在细胞基因组的外源性SV40T抗原基因。实验研究发现该细胞S-100、HMB-45等细胞表型未发生改变，而且软琼脂克隆实验和裸鼠移植实验也未观察到致瘤性。为进一步了解SV40T抗原基因对诱导的RIMC生物学性状和功能，特别是潜在致瘤性的影响，我们对培养至第15代的IMC(immortalizedmelanocytes，IMC)进行染色体分析，免疫组织化学方法检测HLA-DR和hTERT蛋白的表达，RTI-PCR检测hTERTmRNA表达；对第20代细胞进行MTT比色法分析细胞增殖情况，流式细胞仪分析细胞周期和DNA倍体；RT-PCR半定量分析细胞hMLH1、hMSH2错配修复基因表达；并提取细胞基因组，对1p22(D1S187)、5q14(D5S107)、18q12.2-12.3(D18S34)三个位点PCR产物进行变性聚丙烯酰胺电泳分析微卫星不稳定性(microsatelliteinstability,MI)；同时对细胞的酪氨酸酶活性和黑素含量与正常MC进行对比，分析细胞的生物学功能变化。结果表明永生化和去永生化的黑素细胞均保持正常核型、HLA-DR的表达不受体外长期传代培养和SV40T抗原的影响；SV40T抗原不通过上调端粒酶逆转录酶活性途径介导细胞永生化；细胞周期分析和MTT比色法分析细胞增殖实验表明IMC的生长增殖较正常MC明显，长期培养未见复制衰亡现象。而切除SV40T抗原基因后的去永生化黑素细胞可出现部分凋亡，生长变缓；错配修复基因hMLH1、hMSH2在IMC中较正常细胞表达上调；D1S187、D5S107、D18S34三个位点上均未出现条带的增加和缺失，无微卫星不稳定性发生，保持了细胞的遗传稳定性。细胞的酪氨酸酶活性和黑素含量与体外培养的正常MC无明显差别。上述结果说明转化细胞不易向恶性转化，并能保持MC正常的黑素代谢的生物学功能，可以为自体MC移植治疗白癜风和MC的实验研究提供有用的种子细胞。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写一览表

声明

前言

第一部分SV40T-LoxP-PEGFP-N1真核表达载体的克隆和永生化黑素细胞的构建

前言

材料与方法

结果

讨论

第二部分SV40T抗原介导永生化对黑素细胞生物学的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

第三部分Cre/loxP位点特异性重组酶诱导去永生化对黑素细胞生物学的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

全文总结

致谢

参考文献

文献综述：SV40诱导细胞永生化的机制

攻读硕士学位期间发表文章