冰片与抗菌药物体内外联合抗菌作用的研究

摘要

自青霉素问世以来，抗菌药物逐渐占据临床抗感染市场。它犹如一把双刃剑，一方面为人类的健康事业保驾护航，挽救了无数鲜活的生命；另一方面，由于抗菌药物的不合理使用导致耐药菌的蔓延，引发了一系列严重的后果，如超级细菌的产生、药害事件频发等，细菌耐药性已引起全球医疗领域的广泛关注。因此，为实现可持续应用战略，加强抗菌药物应用监管体系、开发新型抗菌制剂逆转细菌耐药性势在必行。
　　近年来，随着医学界对中药资源的广泛和深入研究，其逆转细菌耐药性的作用逐渐引起关注。在其系统的理论指导下，已有大量实践表明中药复方在抗菌、延缓甚至消除细菌耐药性方面极具优势，这为开发新型抗菌药物提供了可能。
　　冰片（Borneol）亦称龙脑、梅花冰片等，分为天然冰片与合成冰片，前者由龙脑香科植物龙脑香Dryobalanops aromatica Gaertnf.树脂或菊科植物艾纳香Blumea balsamifera DC.叶片中提取而得；后者又称机制冰片，以樟脑或者松节油等材料化学合成。冰片成分复杂，因来源而异，作用广泛，《本草衍义》记载冰片“独行则势弱，佐使则有功”，自古用以开窍醒神。此外，冰片可双向调节中枢神经系统、提高生物利用度、抗菌抗炎抗病毒及逆转肿瘤多药耐药等.据报道，冰片对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、乙性溶血性链球菌等表现出明显的抗菌效果，低浓度抑菌，高浓度具有杀菌作用。冰片还可促进庆大霉素的吸收，增加其中枢和血液浓度，但未见其联用对临床常见致病菌的抗菌效果，市场上也未有复方制剂出现。因此本文就冰片和抗菌药物联用对临床常见致病菌的抗菌效果进行探讨。
　　本课题以冰片与临床常用抗菌药物为研究对象，考察了两者联用对临床分离的4种致病菌株（来源于广东省中医院大德路总院住院部检验科）—金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷氏菌、铜绿假单胞菌的体内外联合抗菌效果。采用光电比浊计数法定量菌液浓度；以K-B纸片法考察细菌耐药性获得耐药菌株；以不同方法测定两者体外联合抗菌效果，筛选出具协同作用的组合，并初步探讨最佳配比为体内研究提供前提；建立败血症模型考察体内联合抗菌作用，为后续研究提供依据。
　　（1）采用光电比浊计数法定量菌悬液浓度。以紫外分光光度法测定菌悬液吸光度A，同时以涂板计数法测定稀释后的菌悬液的菌落形成单位数cfu，绘制A-cfu标准曲线，根据吸光度定量菌悬液浓度。结果表明，4种试验菌株的A-cfu曲线分别是：金黄色葡萄球菌y=(297.68x-56.990)×107，R2=0.9988；大肠埃希菌y=(528.15x-133.37)×106，R2=0.9978；铜绿假单胞菌y=(321.85x-45.411)×107，R2=0.9966；肺炎克雷氏菌y=(257.63x-0.4971)×106，R2=0.9986，其中x为吸光度A，y为菌落形成单位数cfu，标准曲线相关性均良好。
　　（2）采用K-B纸片法进行药物敏感性试验,测定临床常用抗菌药物药敏纸片对待测菌株抑菌圈直径的大小，参考美国临床实验室标准化协会（CLSI2010版）相关标准判定待测菌株的药物敏感性。结果表明，金黄色葡萄球菌（编号13583）为耐甲氧西林的菌株，对所有β-内酰胺类抗生素、部分磺胺类抗生素表现出明显的耐药性；大肠埃希菌（编号13920）对所有头孢类、多数青霉素类、氨曲南和部分磺胺类抗生素耐药；铜绿假单胞菌（编号13930）对部分磺胺类抗生素具有明显耐药性，对第三、四代头孢类抗生素亦有较高耐药性；肺炎克雷氏菌（编号13952）对多数抗菌药物产生明显的耐药性，其中对所有头孢类、多数青霉素类、氨曲南明显耐药，此菌株可能产超广谱β-内酰胺酶。
　　（3）研究冰片与抗菌药物体外联合抗菌作用，筛选出具协同抗菌效果的组合并考察两者最佳配比，为体内研究提供理论基础。采用试管二倍稀释法分别考察冰片和临床常用抗菌药物对实验菌株的单独抗菌作用，测定其最低抑菌浓度（MIC）；再采用微量棋盘法考察冰片与抗菌药物联合抗菌效果，测定联合给药时两者的MIC；最后计算其FIC指数，FIC=MIC甲药联用／MIC甲药单用＋MIC乙药联用／MIC乙药单用，结果判定标准：FIC指数≤0.5为协同作用；＞0.5～1为相加作用；＞1～2为无关作用；＞2为拮抗作用。实验结果表明，冰片与9种常用抗菌药物对耐药金黄色葡萄球菌（编号13583）的联合抗菌效果中5种组合表现出协同抗菌作用，4种表现出相加作用，未出现拮抗作用；对耐药大肠埃希菌（编号13920）的联合抗菌效果中7种组合表现出协同抗菌作用，1种表现出相加作用，1种为无关作用，均未出现拮抗作用；对耐药铜绿假单胞菌（编号13930）的联合抗菌效果中6种组合为协同抗菌作用，1种为相加作用，2种为无关作用，均未出现拮抗作用；对耐药肺炎克雷氏菌（编号13952）的联合抗菌效果中5种组合表现出协同抗菌作用，2种表现出相加作用，2种为无关作用，均未出现拮抗作用。结果提示冰片与部分抗菌药物联合使用抗耐药金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌及肺炎克雷氏菌感染时可提高抗菌药物的抗菌效果。不同配比庆大霉素∕冰片、左氧氟沙星∕冰片、头孢他啶∕冰片联用时最低抑菌浓度MIC较抗菌药物单剂均明显降低，其中两者配比为4:1时最为明显，提示抗菌药物∕冰片配比4:1时体外抗菌作用最佳。
　　（4）考察冰片与抗菌药物体内联合抗菌作用，寻找最佳配比组方，为机理研究、临床试验以及新型抗耐药复方制剂的研发提供理论指导。昆明小鼠（体质量18-22g）按体重随机分组，雌雄各半。腹腔注射0.5mL5％高活性干酵母配制的1MLD菌液建立败血症模型，即刻灌胃0.2mL不同配比系列药液，观察并记录各组给药后12、24、36、72h至7d内的小鼠表观症状和存亡率。按Bliss法计算小鼠对感染菌的药物半数有效量ED50和95%可信限。左氧氟沙星与冰片体内抗菌实验结果表明，左氧氟沙星单剂对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷氏菌感染小鼠建立败血症模型的半数有效量ED50分别为54.1、51.6、50.0、53.2㎎∕㎏。冰片单剂的半数有效量ED50分别为749.9、650.5、632.8、683.1㎎∕kg。分别以金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷氏菌感染小鼠建立败血症模型，不同配比左氧氟沙星∕冰片（1:1、2:1、4:1、8:1）合用的ED50值较左氧氟沙星单剂ED50值显著降低，经统计学检验，均存在显著性差异（P＜0.05）。头孢他啶与冰片体内联合抗菌实验结果表明，头孢他啶单剂对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷氏菌感染小鼠建立败血症模型的半数有效量ED50分别为944.7、975.0、882.1、1000.3㎎∕㎏；不同配比头孢他啶∕冰片（1:1、2:1、4:1、8:1）合用的ED50值较头孢他啶单剂ED50值显著降低，经统计学检验，存在显著性差异（P＜0.05）。实验结果表明冰片与抗菌药物联合使用时可提高抗菌药物抗菌作用。
　　通过本文的研究，探讨了冰片与抗菌药物对临床分离的4种耐药菌株的体内外联合抗菌效果，摸索出相应的半数有效量ED50，为后续的机理研究和临床试验提供一定的理论指导。

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中英文缩写词对照表

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前言

1.抗菌药物概述

2 中药的抗菌作用

3 冰片研究概况

4 立题意义与背景

5 主要研究内容

第一部分 细菌计数

引言

1.材料与仪器

1.1 实验材料

1.2 实验主要仪器

2 实验方法

3.实验结果

3.1 金黄色葡萄球菌A-cfu标准曲线

3.2 大肠埃希菌A-cfu标准曲线

3.3 铜绿假单胞菌A-cfu标准曲线

3.4 肺炎克雷氏菌A-cfu标准曲线

第二部分 细菌敏感性测定

引言

1.材料与仪器

1.1 实验菌种

1.2 抗菌药物

1.3 其他材料

1.4 主要实验仪器

1.5 培养基的配制

2 实验方法

2.1 药敏纸片的制备

2.2 药敏试验方法

3.实验结果

4 小结

第三部分 冰片-抗菌药物体外联合抗菌作用的研究

引言

1.材料与仪器

1.1 实验菌种

1.2 药品与试剂

1.3 主要实验仪器

2 主要溶液的配制

2.1 冰片溶液的配制

2.2 各抗菌药物溶液的配制

2.3 菌悬液的制备

3 实验方法

3.1 冰片与抗菌药物单用最低抑菌浓度（MIC）的测定

3.2 冰片与抗菌药物联用MIC的测定

3.3 冰片与抗菌药物最佳配比的选择

4 结果

4.1 抗菌药物与冰片联合抗菌作用的考察

4.2 抗菌药物与冰片联用最佳配比的选择

5 小结

第四部分 冰片与抗菌药物体内联合抗菌作用的研究

引言

1.材料与仪器

1.1 实验菌种

1.2 药品与试剂

1.3 实验动物

1.4 主要仪器

2 实验方法

2.1 待测菌株MLD的确定

2.2 药物剂量分组设计

2.3 药液配制方法

2.4 50%有效剂量（ED50）动物感染保护性试验

2.5 数据处理方法

3 结果

3.1 4种产酶菌株体内感染小鼠败血症最低致死量考察结果

3.2 不同配比左氧氟沙星╱冰片对4种产酶菌感染小鼠的保护性实验结

3.3 不同配比头孢他啶∕冰片对4种产酶菌感染小鼠的保护性实验结果

4小结

第五部分 结论与展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文

致谢